一例大羚羊感染嗜水氣單胞菌的診斷

劉真超

摘要 對2019年1月合肥野生動物園發(fā)生的一例大羚羊死亡病例，經(jīng)臨床觀察、剖檢病理變化以及實驗室診斷相結(jié)合，確診為嗜水氣單胞菌感染。

關(guān)鍵詞 大羚羊;嗜水氣單胞菌;剖檢;診斷

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydro？鄄phila）屬于弧菌科（Vibrionaceae）氣單胞菌屬，為一種革蘭氏陰性短桿菌，無芽孢與莢膜[1]。嗜水氣單胞菌廣泛存在于自然界的各種水體中，是多種水生動物的原發(fā)性致病菌，為條件致病菌，人或動物感染后常常出現(xiàn)腹瀉、敗血癥等癥狀[2]。2019年1月合肥野生動物園有3只大羚羊（Tragelaphus oryx）出現(xiàn)死亡，死亡前未見明顯臨床癥狀。經(jīng)臨床觀察、病理變化以及實驗室診斷相結(jié)合，確診為嗜水氣單胞菌感染。現(xiàn)將該病例的診斷情況報告如下。

1材料與方法

1.1病料來源

合肥野生動物園病死大羚羊。

1.2主要試劑與引物

DL2000Marker、2×Taq PCR Master？鄄Mix、ddH2O均購自天根生化科技（北京）有限公司;藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司;16S rRNA上、下游引物分別為16S Forward（5'？鄄AGAGTTTGATCCTG？鄄GCTCAG？鄄3'）、16S Reverse（5'？鄄TACGGCTACC？鄄TTGTACGACTT？鄄3'），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3細(xì)菌分離與鑒定

1.3.1細(xì)菌分離與純化無菌操作取病死羚羊肝臟、心包液、脾臟接種與兔血瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)，24 h后挑取分別挑取單菌落接種于兔血瓊脂培養(yǎng)基及輔酶培養(yǎng)基上，37℃條件下培養(yǎng)24 h。

1.3.2細(xì)菌染色鏡檢挑取單個菌落進(jìn)行革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.3.3細(xì)菌DNA的提取挑取純化后的單個菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基中，于37℃，220 rpm條件下培養(yǎng)過夜，從菌液中提取細(xì)菌DNA。

1.3.4細(xì)菌16S rRNA的序列測定與鑒定分析以提取的細(xì)菌DNA樣本作為PCR擴(kuò)增反應(yīng)的模板，利用細(xì)菌的16S rRNA引物進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為20 μl，分別為2×Taq PCR MasterMix 10 μl，模板3 μl，上、下游引物各1 μl，ddH2O 5 μl。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，95℃變性45 s，55℃退火1 min，72℃延伸1 min 30 s，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測鑒定后，將產(chǎn)物送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

1.3.5藥敏試驗采取紙片法，按照試劑盒說明書進(jìn)行藥敏試驗。

2結(jié)果與分析

2.1剖檢結(jié)果

剖檢發(fā)現(xiàn)肺臟淤血（圖1A），肝臟綠染（圖1B），心包積液（圖1C），此外還發(fā)現(xiàn)在羚羊的胃內(nèi)有大量的塑料袋碎片（圖1D）。

2.2細(xì)菌分離純化與鏡檢結(jié)果

細(xì)菌經(jīng)分離純化培養(yǎng)后，菌落形態(tài)呈灰白色、圓形、邊緣光滑且中央凸起，在兔血瓊脂培養(yǎng)基上還可見明顯的溶血環(huán)（圖2）。挑取部分菌落涂片，經(jīng)革蘭氏染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)為G-短桿菌（圖3）。

2.3細(xì)菌的16S rRNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果

細(xì)菌16S rRNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可在約1 500 bp處見1條特異性條帶，與預(yù)期條帶大小相符（圖4）

2.4測序結(jié)果與序列分析

將經(jīng)測序得到的菌株的16S rRNA基因序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果顯示與Aeromonas hydrophila GX6（嗜水氣單胞菌GX6株，GeneBank登錄號：KU937368.1）等嗜水氣單胞菌的基因同源性達(dá)99%，結(jié)合以上檢測結(jié)果，該病例可確診為嗜水氣單胞菌感染。PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果如下：

2.5? ?藥敏試驗結(jié)果

藥敏試驗結(jié)果表明該株嗜水氣單胞菌對加替沙星、環(huán)丙沙星、奈替米星、頭孢哌酮、四環(huán)素、氯霉素、氟苯尼考、復(fù)方新諾明、呋喃唑酮、高度敏感;對丁胺卡那、慶大霉素、亞胺培南中度敏感;對克林霉素、林可霉素、氨芐西林、阿莫西林、羅紅霉素耐藥。

3討論

嗜水氣單胞菌廣泛存在于自然界，尤其是淡水環(huán)境中，是一種典型的人-畜-魚共患病原菌[3]。自DUSI JL[4]于1949年首次報道第一例蛙感染嗜水氣單胞菌以及1966年Bulger RJ等[5]首次報道2例人感染嗜水氣單胞菌起，國內(nèi)外陸續(xù)報道過嗜水氣單胞菌感染其他動物的報告，包括豬、雞、長頸鹿、水貂、貉、狐、家兔、大熊貓、鴨、企鵝、黑鸛、噪鹛以及各種常見魚類[6]。此外，嗜水氣單胞菌還常與其他細(xì)菌發(fā)生混合感染。戚偉[7]等報道了一例某豬場仔豬大量死亡的病例，確診為大腸桿菌與嗜水氣單胞菌混合感染所致。該次病例中，在大羚羊的胃內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量殘留的塑料袋碎片，因此可能造成羚羊進(jìn)食、消化困難，機(jī)體免疫力下降，在飲用不衛(wèi)生的水源后，進(jìn)而感染嗜水氣單胞菌。針對此次大羚羊感染嗜水氣單胞菌，應(yīng)結(jié)合藥敏試驗結(jié)果選取高敏藥物用藥，用藥同時嚴(yán)密監(jiān)控大羚羊的情況，發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)及時查明原因，對癥治療。在飼養(yǎng)方面，應(yīng)做好野生動物園動物衛(wèi)生防疫工作，及時改善動物的飼養(yǎng)環(huán)境，并嚴(yán)格遵守飼養(yǎng)環(huán)境的消毒制度。

參考文獻(xiàn)

[1] 胡安東，張明洋，張飄，等. 鯉源嗜水氣單胞菌分離鑒定、耐藥性及毒力基因檢測[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2019，46（7）：2167-2175.

[2] 楊守明，王民生. 嗜水氣單胞菌及其對人的致病性[J]. 疾病控制雜志，2006（5）：511-514.

[3] 李巧玲，張召興，吳同壘，等. 貉源嗜水氣單胞菌的分離及其生物學(xué)特性鑒定[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報，2018，38（9）：1740-1744.

[4] DUSI JL. The natural occurrence of redleg，Pseudomonas hydrophila，in a population of American toads，Bufo americanus[J]. Ohio J Sci.，1949，49（2）：70.

[5] Bulger RJ，Sherris JC. The clinical significance of Aeromonas hydrophila. Report of two cases[J]. Arch Intern Med.，1966，118（6）：562-564.

[6] 陳翠珍. 我國嗜水氣單胞菌感染研究概況[J].河北科技師范學(xué)院學(xué)報，2012，26（4）：61-64.

[7] 戚偉，區(qū)海蘊(yùn)，周亞蘭，等. 豬大腸桿菌與嗜水氣單胞桿菌混合感染病例的診斷及其體外抑菌試驗[J]. 江西畜牧獸醫(yī)雜志，2019（2）：10-14.

責(zé)任編輯：劉赟