柚皮苷改善CCL2所致大鼠學習記憶障礙及其機制

龍江宜，陳健民，廖苑君，周怡俊，梁冰玉，周 燕

(廣西醫科大學1.藥學院、2. 廣西艾滋病防治研究重點實驗室，廣西 南寧 530021)

CC類趨化因子配體2(chemokine CC motif ligand 2，CCL2)，又稱為單核細胞趨化蛋白-1 (monocyte chemoattractant protein -1，MCP-1) ，是CC類趨化因子家族的重要成員。CCL2作為趨化作用最強的因子之一，對單核吞噬細胞、活化的T細胞和B細胞具有強大的激活和募集作用。此外，研究發現，CCL2在中樞神經系統(central nervous system，CNS)中扮演著重要的角色。生理條件下，CCL2能維持神經元的正常活性，并參與神經元通訊交流等生理功能[1]。然而，過表達的CCL2參與了多種CNS疾病發生的病理生理過程。研究發現，在阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease，AD)、血管性癡呆(vascular dementia，VD)和艾滋性認知功能障礙(HIV-associatedneurocognitive disorder，HAND)等患者的腦脊液中均檢測到CCL2的高水平表達，而這些患者均伴隨有不同程度的認知功能障礙[1, 2]，表明CCL2與中樞神經系統疾病的發生密切相關。

氧化應激、炎癥反應、興奮性毒性以及細胞凋亡是中樞神經系統疾病的主要發病機制，我們的前期研究發現CCL2通過過度激活N-甲基-D-天冬酰胺受體(N-methyl-D-aspartate receptors, NMDAR)能損傷大鼠的學習記憶和認知功能，其機制與上述四條途徑均有聯系。因此，我們認為CCL2作為誘導認知功能障礙等神經退行性疾病的重要致病因子，針對CCL2觸發認知障礙的機制有抑制或者阻斷作用的藥物將在治療認知功能障礙或者提高學習記憶力方面展現出良好的臨床運用前景，但目前在神經藥理領域關于對抗CCL2效應及作用的藥物研究還十分有限。

柚皮苷(naringin)是一種存在于葡萄柚和其他柑橘類水果中的黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化應激、調節糖脂代謝和保護心肌等多種生物學保護作用，能通過調節氧化應激和炎癥反應對心血管疾病、糖尿病的治療及神經變性的預防起到良好作用[3, 4]。有研究發現，柚皮苷能下調動脈粥樣硬化和炎癥反應中CCL2的表達，起到抗動脈粥樣硬化和抗炎作用[5]。此外，柚皮苷能夠增強人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)膜糖蛋白120(glycoprotein 120，gp120)誘導艾滋性認知功能障礙的大鼠學習記憶能力，改善其認知功能障礙[6]。而關于柚皮苷是否能對抗CCL2誘發的認知功能障礙還尚未可知，故本文通過腦部立體注射將CCL2注射至雙側海馬腦區，制作認知功能障礙大鼠模型，預防性3 d給予柚皮苷，利用Morris水迷宮(Morris water maze，MWM)評價柚皮苷對CCL2誘發的認知功能障礙模型大鼠學習記憶能力的影響，并從形態學、氧化應激、細胞凋亡三個方面評價其保護機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器CCL2(R&D systems，批號：279-MC/CF)，柚皮苷(Sigma公司；批號BCBT3477)，美金剛(memantine，批號：M9292)，caspase-8、caspase-3、Bax、Bcl-2、GAPDH引物(上海捷瑞生物工程有限公司)；AxyPrep總RNA制備試劑盒(康寧生命科學有限公司，批號：07418KD1)；逆轉錄試劑盒(TaKaRa，批號：RR047A)；SYBR熒光染料擴增試劑盒(TaKaRa，批號：RR820A)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutas，SOD)試劑盒(南京建成生物工程所，批號:20181121)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒(南京建成生物工程所，批號：20181029)；谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)試劑盒(南京建成生物工程所，批號：20181116)BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天，批號：P0010S)。腦立體定位儀(深圳瑞沃德生命科技有限公司，型號C9S02-003)；手型顱骨鉆(深圳瑞沃德生命科技有限公司，型號68605)；10 μL Hamilton微量注射器(Hamilton公司，型號：701N)；Morris水迷宮實驗裝置及分析系統(淮北正華生物儀器設備有限公司)

1.2 實驗動物分組及處理56只SPF級♂SD大鼠，體質量(180±20)g，購自于廣西醫科大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證：SCXK桂2014-0002，實驗動物使用許可證：SCXK桂2014-0003。適應性喂養1周，允許自由攝食飲水。SD大鼠隨機分為7組：空白對照組(control)、假手術組(sham)、模型組(5 ng CCL2)組、陽性藥組(5 ng CCL2+10 mg·kg-1memantine)、柚皮苷低劑量組(5 ng CCL2+25 mg·kg-1柚皮苷)、柚皮苷中劑量組(5 ng CCL2+50 mg·kg-1柚皮苷)和柚皮苷高劑量組(5 ng CCL2+100 mg·kg-1柚皮苷)，每組8只。除空白對照組外，其余各組均進行雙側海馬內注射制作動物模型，陽性藥美金剛(memantine)及各劑量柚皮苷組于造模前3 d腹腔注射(ip)，d 3藥物注射后的30 min后進行腦部立體定位手術。

1.3 模型制備配制1%的戊巴比妥鈉溶液，按45 mg·kg-1劑量腹腔注射麻醉。待動物麻醉后，顱頂區常規備皮，碘伏消毒。參照大鼠腦立體定位圖譜，以前囟為原點，按AP=-3.7 mm、ML=±3.0 mm、DV=-3.0 mm的坐標位置進行海馬區注射，注射速度為0.3 μL·min-1，每側注射體積為2.5 μL，注射完成后停針5 min避免藥物外漏，隨后緩慢提針。注射完成后縫合皮膚，并注射青霉素(30萬單位·kg-1)防止感染。假手術組給予等量無菌生理鹽水。

1.4 Morris水迷宮實驗Morris水迷宮試驗主要通過Morris水迷宮分析系統完成，包括一個圓形水池、視頻采集系統、軟件分析系統。水池直徑160 cm,高60 cm，實驗時在水池內注入自來水，水深42 cm，水溫(22±1) ℃。將水池池壁分為四等份，分別記為E、S、W及N四個象限，在每個象限的池壁部分中心放置大小相近，不同形狀的白色標記物，用于幫助大鼠空間定位。在象限S的中心處放置一個位于水下2 cm、直徑為12 cm、高40 cm的水下平臺。在實驗過程中平臺位置不變。

大鼠術后3 d開始進行Morris水迷宮實驗，通過Morris水迷宮試驗評測SD大鼠學習和空間記憶能力。參照以往方法[7]進行。Morris水迷宮試驗包括定位航行試驗(D4～D8)和空間探索試驗(D9)兩部分。在定位航行試驗前1 d(D3)即術后d 3對大鼠進行適應性訓練。即將大鼠從任一入水點放入水中，自由游泳1 min。定位航行試驗著重檢測大鼠的學習能力，其評價指標包括逃避潛伏期、游泳速度及游泳距離；空間探索試驗在定位航行試驗后24 h進行，主要用于評價大鼠的空間記憶力，其評價指標為大鼠穿過原水下平臺位置的次數，即穿越次數。

1.5 HE染色水迷宮實驗后，每組4只大鼠心臟灌注后取全腦石蠟包埋切片進行HE染色，以探究CCL2是否對大鼠海馬神經元CA1區造成損傷。HE按照常規方案進行，5～7 μm縱切片，二甲苯脫蠟蘇木素-伊紅染色。后用中性樹脂密封，使用Olympus BX53顯微鏡拍攝。

1.6 SOD、GSH-Px活力以及MDA含量檢測Morris水迷宮實驗后將各組大鼠于冰上迅速斷頭取腦，分離海馬組織。取每組4只大鼠的一側海馬用于氧化應激指標檢測。冰上研磨海馬組織制備10%的海馬勻漿，BCA法檢測各樣本蛋白總濃度，試劑盒檢測SOD、GSH-PX活力以及MDA含量。

1.7 凋亡基因caspase-8、caspase-3、Bax以及Bcl-2基因表達檢測上述大鼠的另一側海馬用于凋亡相關基因檢測。按柱式RNA提取試劑盒的說明提取總RNA，微量核酸蛋白濃度測定儀檢測各樣本RNA的濃度及吸光度。按逆轉錄試劑盒的說明將RNA逆轉錄成cDNA，按擴增試劑盒的說明對目的基因進行擴增，獲得各目的基因的擴增曲線和熔解曲線，記錄各基因的Ct值，以GAPDH為內參基因，2-ΔΔCt法計算結果，引物序列見Tab 1。

Tab 1 Primers’ sequence of target genes

2 結果

2.1 柚皮苷對大鼠學習能力的保護作用結果如Tab 2，Fig 2和Fig 3，Fig 4所示，各組大鼠平均游泳速度差異均無統計學意義，說明各組大鼠運動能力一致，并且腦部立體定位手術對大鼠運動能力沒有明顯影響。與假手術組相比，模型組大鼠逃避潛伏期增加(P<0.01)；與模型組大鼠相比，柚皮苷給藥組大鼠逃避潛伏期及游泳總路程均縮短(P<0.01)。Fig 1顯示的是定位航行實驗d 5各組大鼠的游泳軌跡。

Tab 2 Results of swimming speed, escape time and swimming distance of rats in each group

**P<0.01vsmodel；##P<0.01vssham

2.2 柚皮苷對大鼠空間記憶的保護作用結果如Tab 3，Fig 5所示，與假手術組相比，模型組大鼠組穿越平臺次數減少(P<0.01)；與模型組相比，柚皮苷給藥組大鼠穿越平臺次數增加(P<0.05)。

2.3 柚皮苷對大鼠的海馬CA1區神經元結構的保護作用結果如Fig 6所示，與空白組和假手術組相比，模型組大鼠海馬組織CA1區神經元排列松散，胞體固縮，細胞核深染，出現大量鬼影細胞；與模型組相比，各柚皮苷給藥組，尤其是中、高劑量組大鼠海馬組織CA1區神經元排列相對緊密，核深染和固縮的細胞數目較少。

Fig 1 Typical swimming path of rats in navigation test on 5th training day

Fig 2 Swimming speed of rats in each

Tab 3 Results of crossing times of rats in each group

*P<0.05，**P<0.01vsmodel；#P<0.05vssham

Fig 3 Escape latency of rats in each

**P<0.01vsmodel;##P<0.01vssham

Fig 4 Swimming distance of rats in each

**P<0.01vsmodel;##P<0.01vssham

*P<0.05,**P<0.01vsmodel;#P<0.05vssham

2.4 柚皮苷對大鼠海馬組織SOD、MDA、GSH-PX的影響結果如Tab 4，Fig 7所示，與假手術相比，模型組大鼠海馬組織SOD、GSH-PX活力均降低，MDA含量增加(P<0.05)；與模型組相比，柚皮苷給藥組海馬組織SOD、GSH-PX活力均升高，MDA含量降低(P<0.05)。

Fig 6 Neuronal structure of hippocampal CA1 area in rats among groups(×20)

2.5 柚皮苷對大鼠海馬組織caspase-3、caspase-8、Bax、Bcl-2 mRNA表達的影響結果如Table 5，Fig 8所示，與假手術組相比，模型組大鼠海馬組織caspase-3、caspase-8、Bax mRNA相對表達量增加(P<0.05)，Bcl-2mRNA表達量降低(P<0.05)；與模型組相比，柚皮苷給藥組大鼠海馬組織caspase-3、caspase-8、Bax mRNA的相對表達量降低(P<0.05)，Bcl-2相對表達量升高(P<0.05)。

3 討論

趨化因子CCL2，也稱為MCP-1，屬于CC類趨化因子家族，是趨化活性最強的趨化因子之一[8]。

*P<0.05,**P<0.01vsmodel;#P<0.05，##P<0.01vssham

Tab 4 Results of SOD activity, MDA content, GSH-PX activity in hippocampus of rats in each group

*P<0.05，**P<0.01vsmodel；#P<0.05，##P<0.01vssham

Tab 5 Relative expression of caspase-8, caspase-3, Bcl-2 and Bax mRNA in rat hippocampus

*P<0.05，**P<0.01vsmodel；#P<0.05，##P<0.01vssham

Fig 8 Relative expression of caspase-3, caspase-8, Bax and Bcl-2mRNA in rat hippocampus

*P<0.05,**P<0.01vsmodel;#P<0.05，##P<0.01vssham

研究發現，異常高表達的CCL2參與多種神經系統疾病如缺血性腦卒中，創傷性腦外傷以及神經退行性疾病的病理生理過程。大腦中激活狀態的小膠質細胞和星型膠質細胞能釋放CCL2，通過促炎性反應上調炎癥介質IL-1β、TNF-α的表達，從而介導炎癥反應，損傷神經元[8]。除參與炎癥反應外，課題組前期研究發現，CCL2能通過誘導海馬區氧化應激和興奮性毒性，并最終促進海馬區細胞凋亡，導致大鼠學習記憶和認知功能的減退，這一現象與臨床數據相吻合。研究人員從AD、VD以及HAND等疾病[4]患者的腦脊液中檢測到高水平表達的CCL2，且其表達水平與患者出現的認知障礙程度呈現正相關性[1, 2, 9]，表明CCL2在中樞神經系統疾病的發病過程中扮演了十分重要的角色。

目前針對CCL2為治療靶點的中樞神經系統治療藥物的研究十分有限。因此本課題組擬在前期對CCL2中樞致病機制研究的基礎上以期尋找一些能對抗CCL2的潛在治療藥物。柚皮苷(naringin)是一種天然存在于葡萄柚和其他柑橘類水果中的黃酮類化合物，被證明具有抗炎、抗氧化、調查糖脂代謝和保護心肌等多種生物學功效[4, 6, 10]。此外，研究發現柚皮苷能下調動脈粥樣硬化中炎癥因子CCL2的表達[5]，起到血管內皮細胞保護作用。因此，我們設計實驗研究柚皮苷是否能在神經系統對CCL2誘導的學習記憶損傷有保護作用。

Morris水迷宮實驗是行為神經科學研究中最長用的研究工具之一，常用于驗證嚙齒類動物神經認知疾病模型，評估神經認知功能治療的可行性。我們的前期研究已經證實：CCL2雙側海馬注射能成功制作認知功能障礙大鼠模型，通過Morris水迷宮實驗可以確定模型組大鼠的學習記憶能力受到顯著損傷[7]，本研究進一步在此認知功能障礙大鼠模型上，探究柚皮苷能否改善大鼠的學習記憶力。經典的Morris水迷宮實驗由定位航行實驗和空間探索實驗兩部分組成，前者著重檢測嚙齒動物的學習能力，后者主要用于檢測動物記憶的維持能力。我們的研究結果表明：(1)在定位航行試驗中，各組大鼠游泳速度均無明顯差異，表明我們的手術未對大鼠的運動能力造成影響。在預防性給予柚皮苷給藥3 d后，柚皮苷給藥組大鼠逃避潛伏期和游泳路程較模型組均顯著降低，表明柚皮苷能夠對CCL2損傷大鼠的學習能力起到保護作用。(2)在空間探索實驗中各柚皮苷給藥組穿越次數顯著高于模型組，顯示出良好的對大鼠空間記憶保護能力。兩部分實驗結果具有高度一致性，表明柚皮苷能很好的保護由CCL2海馬注射誘發的大鼠學習記憶力損傷。

海馬是與學習記憶密切相關的腦區之一，主要參與近期陳述性記憶和情景記憶的形成，其功能的完整性依賴于海馬神經元結構和功能的完整。故在上述行為學實驗結束后，我們利用HE染色觀察各組大鼠海馬區神經元結構。HE結果顯示模型組大鼠海馬組織CA1區神經元條帶淺薄且排列松散，出現神經元胞質深染，胞體縮小變形；柚皮苷給藥后，各組大鼠，尤其是中高劑量大鼠海馬組織CA1區神經元排列相對整齊，細胞結構相對清晰，表明柚皮苷對CCL2誘導的海馬神經元結構損傷具有良好保護作用，與上述行為學結果一致。

氧化應激是導致學習記憶和認知障礙的原因之一，在癡呆發生的早期扮演重要的作用[11]。正常情況下，機體內的氧化-抗氧化系統維持相對動態平衡的狀態，過多的反應活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)會被自身的抗氧化酶SOD、GSH-PX清除，但當氧化程度超過自身清除能力的時候，氧化平衡將被打破，導致神經組織氧化應激損傷最終引起學習記憶和認知功能受損。SOD是一種內源性抗氧化酶，是機體清除超氧陰離子等自由基的重要物質，超氧陰離子存在機體多個組織中，性質活波，與羥基結合后可形成損害細胞的物質，SOD可阻斷并對抗氧自由基對組織細胞的損害。此外，GSH-PX是機體廣泛存在的另一種重要的催化過氧化氫分解的酶。它特異性的催化還原性谷胱甘肽(glutathione，GSH)對過氧化氫的還原反應，清除體內自由基、脂質過氧化物并能防止血紅蛋白及其他輔因子受氧化損傷。MDA是脂質過氧化物的主要代謝產物，主要是由于ROS攻擊細胞膜產生，能間接反映神經細胞的損傷程度。我們前期研究發現CCL2能降低海馬區SOD活力并升高MDA含量，表明CCL2能誘導海馬發生氧化應激[7]。據報道，柚皮苷通過抗氧化應激改善2型糖尿病大鼠認知缺陷[4]，說明柚皮苷具有一定的抗氧化作用。但是，柚皮苷是否能對抗中樞神經系統CCL2引起的氧化應激反應尚未可知。本研究表明，柚皮苷能提高中樞海馬組織SOD和GSH-PX兩種抗氧化酶的活性，并減低脂質過氧化物產物MDA的含量，起到明顯抗氧化作用，說明在CCL2誘導的認知功能障礙模型大鼠上，柚皮苷的神經保護作用與抗氧化效應密切相關。

細胞凋亡是機體內清除老化、壞死的細胞結構，為維持內環境穩態的細胞的程序性死亡，有利于保證機體的正常生理功能。然而，在如氧化應激等條件刺激下，凋亡的異常發生往往參與了神經退行性疾病的病理生理過程[12]。本研究中，我們發現在模型組大鼠海馬CA1區神經元出現明顯的細胞死亡現象，而用柚皮苷干預后能明顯改善其神經元的形態結構損傷，顯示出了一定的神經保護作用。課題組前期研究發現CCL2能通過誘導海馬區氧化應激上調促凋亡基因caspase-8、caspase-3、Bax的表達，下調抗凋亡基因Bcl-2的表達誘導海馬神經元凋亡[7]。本研究在前期研究基礎上，進一步探討柚皮苷的抗凋亡作用。我們的實驗結果顯示，柚皮苷能通過下調促凋亡基因caspase-8、caspase-3以及Bax的表達，上調抗凋亡基因Bcl-2的表達，在CCL2誘導的認知功能障礙模型大鼠上發揮良好的抗凋亡效應。

綜上，本研究發現柚皮苷能對抗CCL2引起的神經元結構損傷，改善CCL2誘導的學習記憶損害和認知障礙，其神經保護機制主要是通過降低CCL2誘導的海馬氧化應激反應，抑制caspase-8，caspase-3凋亡通路，并下調促凋亡基因Bax，上調抗凋亡基因Bcl-2而發揮抗凋亡效應，保護神經元，并最終改善學習記憶力。

(致謝：本文中水迷宮實驗在廣西醫科大學公共衛生學院完成，試劑盒、RT-PCR在廣西醫科大學醫學實驗中心細胞與免疫實驗室完成。感謝各位老師和同學給予的幫助。)