丙戊酸通過GSK3β/β-catenin信號軸抑制胃癌細胞的增殖和遷移

孫 潔，樸俊杰,2，秦云植，任香善,2，王馨悅，林貞花,2

(1. 延邊大學醫學院病理學教研室，2. 吉林省科技廳重點實驗室，3. 延邊大學附屬醫院麻醉科，吉林 延吉 133002)

胃癌是導致腫瘤患者死亡的第三大常見病因[1]。近幾年，隨著分子靶向治療和免疫治療的發展，我國胃癌患者的5年生存率雖有所提高(約為36%)，但與日、韓等其他胃癌高發國相比仍存在較大差距(日、韓胃癌患者的5年生存率均超過60%)[2]。轉移和復發是影響胃癌患者病死率的主要原因。因此，有效抑制轉移將有助于改善胃癌患者的預后。丙戊酸(valproic acid，VPA)是一種臨床上廣泛應用的抗癲癇藥，也是一種組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)抑制劑。研究顯示，VPA參與多種腫瘤(如惡性膠質瘤[3]、非小細胞肺癌[4]、前列腺癌[5]等)的轉錄調控，可誘導細胞周期阻滯、凋亡的發生[5]，同時，對于血管形成和轉移也具有一定的抑制作用。在腫瘤治療方面，目前的熱點主要是將VPA與化療藥物聯用來提高化療的抗腫瘤效果[6]。但是，將VPA與何種化療藥物聯用能夠更加有效地抑制腫瘤的演進則缺乏相關研究。因此，本研究旨在探究VPA對胃癌細胞增殖、遷移能力的影響及可能涉及的分子機制，從而為VPA的聯合用藥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 人胃癌細胞株AGS、SGC-7901、MGC-803和BGC-823均由延邊大學腫瘤研究中心提供。

1.1.2試劑 胎牛血清(10100147)、RPMI1640(C11875500BT)、青霉素/鏈霉素(15140-122)均購自美國Gibco公司。二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(D8371)、四甲基偶氮唑鹽[3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide，MTT ](M8180)均購自北京索萊寶生物科技有限公司。低熔點瓊脂糖(M0815)購自美國Amresco公司。BCA蛋白定量試劑盒(CW0014)購自北京康為世紀生物科技有限公司。VPA(PHR1061)購自美國Sigma Aldrich公司。兔抗上皮鈣黏素(E-cadherin)(3195)、兔抗鋅指轉錄因子(Snail)(3879)、兔抗β聯蛋白(β-catenin)(8480)、兔抗磷酸化糖原合成酶激酶3(p-GSK3βser9)(5558)等抗體均購自美國Cell Signaling Techology公司。小鼠抗波形蛋白(Vimentin)(ab8978)抗體購自美國Abcam公司。小鼠抗β肌動蛋白(β-actin)(TA-09)抗體、HRP 標記的山羊抗兔二抗(ZB-2301)和HRP 標記的山羊抗小鼠二抗(ZB-2305)均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。山羊抗兔熒光二抗Alexa Fluor? 488(A-11034)、山羊抗小鼠熒光二抗Alexa Fluor? 568(A-11004)均購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.1.3儀器 CO2恒溫培養箱(美國Thermo 公司)；全波長多功能酶標儀( 瑞士Tecan 公司) ；光學倒置顯微鏡(日本Olympus 公司)；ChemiDoc 成像系統(美國Bio-Rad 公司)；熒光顯微鏡(日本Olympus 公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 將AGS、SGC-7901、MGC-803和BGC-823細胞置于含100 mL·L-1胎牛血清、100 IU·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素的RPMI1640培養基中，在37 ℃、5% CO2的培養箱中培養。

1.2.2MTT實驗 將細胞消化、離心并以每孔5×103個/100 μL的細胞數接種于96孔板。培養8 h后，加入終濃度為0、2、4、6和8 mmol·L-1的VPA，每個藥物濃度設置5個平行復孔。分別培養24 h、48 h和72 h后，每孔內加5 g·L-1的MTT溶液20 μL。隨后，培養4 h棄去上清液，每孔內加100 μL 的DMSO, 震蕩10 min之后，使用全波長酶標儀于570 nm波長測定各培養孔的吸光值(A)。根據公式計算細胞生存率：細胞生存率/%=(用藥組吸光值/對照組吸光值)×100%。

1.2.3軟瓊脂克隆形成實驗 于6孔板中制備雙層瓊脂糖凝膠(含100 mL·L-1胎牛血清)：下層濃度為12 g·L-1，待凝固后，將5×103個細胞與濃度為7 g·L-1的瓊脂糖凝膠混合均勻并注于下層膠上。在37 ℃、5% CO2的培養箱中培養2周后，觀察細胞克隆數并拍照、計數。

1.2.4劃痕愈合實驗 將細胞等量接種于6孔板中，待融合度達到90%時，用200 μL的槍頭在單層細胞上劃痕。用PBS清洗漂浮的細胞。分別加入終濃度為0和3.5 mmol·L-1的VPA/RPMI1640培養基。分別于培養0、24和48 h后觀察、拍照。

1.2.5Transwell遷移實驗 將細胞以5×104個/100 μL 的濃度接種于Transwell上室。貼壁后，上室分別加入終濃度為0 mmol·L-1和3.5 mmol·L-1的VPA/RPMI1640無血清培養基，下室加入800 μL RPMI-1640完全培養基， 37 ℃、5% CO2的培養箱中培養24 h，終止培養。依次進行多聚甲醛固定、結晶紫染色、脫色、取膜、封片后于顯微鏡下觀察、拍照計數。

1.2.6免疫印跡實驗 用藥處理結束后，經PBS洗滌、收集細胞，加入裂解液提取總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒測定各組蛋白的濃度。各組蛋白取40 μg樣本進行凝膠電泳、轉膜、5 g·L-1脫脂牛奶封閉1 h后，以1 ∶1 000的比例稀釋兔抗E-cadherin抗體、小鼠抗Vimentin抗體、兔抗Snail抗體、兔抗β-catenin抗體、兔抗p-GSK3βser9抗體和小鼠抗β-actin抗體。一抗4 ℃孵育過夜。次日，用TBS-T洗膜，以1 ∶3 000的比例稀釋山羊抗兔二抗或山羊抗小鼠二抗，室溫孵育2 h后，用ECL法顯影、曝光，以β-actin為內參。

1.2.7免疫熒光染色 于6孔板中分組爬片用藥，培養48 h后，依次進行PBS洗滌、多聚甲醛固定、Triton-100透化、胎牛血清封閉后，以1 ∶500的比例稀釋兔抗E-cadherin抗體和小鼠抗Vimentin抗體。一抗4 ℃孵育過夜。次日，PBS洗滌后，以1 ∶400的比例稀釋山羊抗兔熒光二抗或山羊抗小鼠熒光二抗，室溫避光孵育2 h。PBS洗滌后，滴入含DAPI的封片劑封片，于熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.8生物信息學分析 通過STITCH在線數據庫篩選VPA的靶向基因；利用STRING在線數據庫對VPA的靶向基因進行蛋白互作網絡分析；應用Enrichr數據庫對VPA的靶向基因進行分子功能分析(GO)和相關通路分析(KEGG)。

2 結果

2.1 VPA抑制AGS、SGC-7901、MGC-803和BGC-823細胞的增殖活性并呈劑量和時間依賴性分別以0、2、4、6和8 mmol·L-1的VPA處理AGS、SGC-7901、MGC-803和BGC-823細胞24 h、48 h和72 h后，MTT實驗結果顯示，VPA可抑制這4種胃癌細胞的增殖活性，且隨著用藥濃度的升高、用藥時間的延長，細胞活性逐漸降低，呈劑量和時間依賴性(P<0.05,P<0.01，Fig 1)。根據MTT的結果，選取AGS和SGC-7901細胞，3.5 mmol·L-1用藥濃度和48 h用藥時間進行后續實驗(VPA處理48 h時，AGS細胞的IC50為3.25 mmol·L-1，SGC-7901細胞的IC50為3.65 mmol·L-1)。根據這一結果，將3.5 mmol·L-1作為后續實驗的用藥濃度。

2.2 VPA抑制AGS和SGC-7901細胞的錨定非依賴性增殖能力軟瓊脂克隆形成實驗的結果顯示：與對照組相比，VPA用藥組的克隆形成數量明顯減少，且差異具有統計學意義(P<0.01，Fig 2)，提示VPA可抑制AGS和SGC-7901細胞的錨定非依賴性增殖能力。

2.3 VPA抑制AGS和SGC-7901細胞的遷移能力劃痕愈合實驗和Transwell遷移實驗的結果均顯示，與對照組相比，VPA用藥組細胞的橫向遷移能力和縱向遷移能力均受到了明顯抑制(P<0.01，Fig 3)，提示VPA可有效抑制AGS和SGC-7901細胞的遷移能力。

2.4 VPA抑制AGS和SGC-7901細胞的上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)進程Western blot實驗結果顯示，與對照組相比，VPA用藥組其上皮標志物E-cadherin表達上調，間質標志物Vimentin、Snail表達下調，且差異具有統計學意義(P<0.01)。免疫熒光實驗結果也證實，與對照組相比，VPA用藥組的E-cadherin表達水平明顯上調， Vimentin的表達水平明顯下調(Fig 4)。

Fig 1 Effect of VPA treatment on proliferation of AGS, SGC-7901, MGC-803 and BGC-823 cells in

Cell viability of AGS, SGC-7901, MGC-803 and BGC-823 cells treated by VPA for 0、 2、 4、 6 and 8 mmol·L-1was measured by MTT assay.*P<0.05，**P<0.01vscontrol group.

Fig 2 Effect of VPA treatment on anchorage-independent growth of AGS and SGC-7901 cells in

A:Soft agar colony formation assay(×40); B:Quantification of results.**P<0.01vscontrol group.

Fig 3 Effect of treatment with VPA on migration of AGS and SGC-7901 cells determined by

A:Scratch wound-healing assay(×40); B:Quantification of results; C:Transwell assay(×200); D:Quantification of results.**P<0.01vscontrol group.

2.5 VPA抑制GSK3β/β-catenin信號軸的激活通過STITCH數據庫篩選出與VPA存在靶向關系的蛋白(Fig 5)，其中包括影響腫瘤細胞分化、增殖及轉移的關鍵蛋白——GSK3β。通過STRING和Enrichr數據庫對GSK3β進行了GO分析和KEGG通路分析，結果顯示GSK3β在胃癌中主要與Wnt信號通路存在信號轉導關系，同時與Wnt信號通路的關鍵蛋白β-catenin存在結合關系。Western blot實驗結果顯示，與對照組相比，VPA用藥組其p-GSK3βser9和β-catenin均明顯下調，且差異具有統計學意義(P<0.01)，提示VPA抑制GSK3β/β-catenin信號軸的激活。

3 討論

人體內組蛋白的乙酰化和去乙酰化平衡動態調節著基因的穩定性[7]。目前的研究顯示，組蛋白乙酰化的失衡與腫瘤的發生發展密切相關[8]。當組蛋白呈過度去乙酰化態時，可下調抑癌基因的表達、激活/上調原癌基因的過表達，從而推進腫瘤的發生發展。因此，增強組蛋白乙酰化酶(histone acetylene transferase，HAT)的作用和(或)降低HDACs的作用一直是表觀遺傳學抗腫瘤研究的重要方向之一。本研究中使用的VPA為Ⅰ類和Ⅱ類HDAC(HDAC6和HDAC10除外)的抑制劑[9]，可使誘導組蛋白H3 和H4的氨基末端發生超乙酰化，從而發揮抗腫瘤作用[10-11]。

在本研究中，我們通過MTT法檢測了VPA對胃癌細胞AGS、SGC-7901、MGC-803和BGC-823增殖活性的影響。結果顯示，VPA可以顯著抑制這4種細胞的增殖活性，且呈劑量和時間依賴性，表明VPA對于胃癌細胞的藥物作用具有較強的廣譜性。選用對VPA較為敏感的AGS和SGC-7901細胞作為實驗對象后，進一步的軟瓊脂克隆形成實驗的結果顯示，VPA可以抑制AGS和SGC-7901細胞的錨定非依賴性增殖能力，提示VPA可以從細胞活性和細胞數量這兩個方面抑制胃癌細胞的增殖能力。這一結果與Zhang等[12]的研究結果相一致。

Fig 4 EMT progression of AGS and SGC-7901 cells suppressed

A:Expression of E-cadherin, Vimentin and Snail was detected in VPA-treated AGS and SGC-7901 cells by Western blot. β-actin was set as loading control; B:Expression of E-cadherin and Vimentin in VPA-treated AGS and SGC-7901 cells was detected by immunofluorescence staining(×400).**P<0.01vscontrol group.

Fig 5 Blockade of GSK3β/β-catenin signal axis by VPA in AGS and SGC-7901

A-C:Network of VPA-GSK3β/β-catenin interactions in STITCH database, STRING database and Enrichr database; B:Expression of p-GSK3βser9and β-catenin was detected in VPA-treated AGS and SGC-7901 cells by Western blot. β-actin was set as loading control.**P<0.01vscontrol group.

大量研究證實，Wnt/β-catenin信號通路的激活不僅參與腫瘤的形成，也參與EMT進程的啟動。GSK3β作為β-catenin上游重要的負性調控因子，其失活與β-catenin的表達呈正相關。而GSK3β的活性主要受磷酸化位點的調控。當GSK3β的N-端絲氨酸9位點(Ser9)發生磷酸化時，其活性受到抑制；當GSK3β的N-端酪氨酸216位點(Tyr 216)發生磷酸化，則可增強GSK3β的活性。在本研究中，通過STITCH、STRING和Enrichr數據庫發現，VPA與GSK3β/β-catenin信號軸存在顯著相關性。Western blot實驗結果也證實，VPA可以抑制GSK3β/β-catenin信號軸的激活，提示GSK3β/β-catenin信號軸參與了VPA對胃癌細胞增殖和遷移功能的調控。

綜上，VPA可有效抑制胃癌細胞的增殖和遷移，其機制可能與抑制GSK3β/β-catenin信號軸的激活及逆轉EMT的進程有關。

(致謝:本實驗是在吉林省科技廳重點實驗室、延邊大學腫瘤研究中心分子病理實驗室完成，感謝實驗室各位老師的指導與幫助。)