李順紅 黃鳳玲 賀曉光



摘 要:本實驗建立了高效液相色譜法測定乳制品中富馬酸二甲酯。檢測波長為280 nm, WondaSil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相為甲醇-緩沖溶液(55∶45),柱溫40 ℃。氨水甲醇溶液作為提取劑、超聲15 min、轉(zhuǎn)速5 000 r·min-1、pH值6.0條件下測得富馬酸二甲酯回收率最高,檢出限為0.60 μg·mL-1,定量限為1.82 μg·mL-1,平均回收率102.05%,精密度RSD為0.053%,該方法簡單、快速、準確,適用于乳制品中富馬酸二甲酯檢測。
關(guān)鍵詞:乳制品;富馬酸二甲酯;提取條件;高效液相色譜法
Abstract:A high performance liquid chromatography (HPLC) was established for the determination of dimethyl fumarate in dairy products. The detection wavelength was 280 nm, WondaSil C18 Chromatographic column (4.6 mm×250 mm,
5 μm). The mobile phase was methanol-Buffer solution (55∶45), and the column temperature was 40 ℃. The recovery of dimethyl fumarate was the highest under the condition of ammonia water methanol solution as extractant, ultrasound for
15 min, rotating speed of 5 000 r·min-1 and pH value of 6.0.The detection limit was 0.60 μ g·mL-1, the quantitative limit was 1.82 μg·mL-1, the average recovery was 102.05%, and the precision RSD was 0.053%.The method is simple, rapid and accurate, and is suitable for the detection of dimethyl fumarate in dairy products.
Key words:Dairy products; Dimethyl fumarate; Extraction conditions; HPLC.
中圖分類號:TS252.7
富馬酸二甲酯(DMF)是一種新型抗菌劑和防霉劑,又稱霉敵。由于富馬酸二甲酯對抑制霉菌、酵母菌和細菌的生長有顯著效果[1],抗菌活性幾乎不受pH影響,對乳制品的防霉效果優(yōu)于丙酸鹽、山梨酸及雙乙酸鈉等酸性防腐劑,因而被廣泛應(yīng)用于乳制品、蔬菜、面粉、熟食、飼料及化妝品中用于防霉[2]。在常溫下,富馬酸二甲酯易升華,對人的眼睛、呼吸系統(tǒng)和黏膜有刺激作用,它可在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成甲醇,對腸道、內(nèi)臟等器官有毒副作用,尤其對兒童的成長發(fā)育危害極大[3]。
我國衛(wèi)生部禁止在食品中添加富馬酸二甲酯[4]。一些不法食品生產(chǎn)者為降低成本、延長產(chǎn)品保質(zhì)期,仍然在乳制品中違法使用富馬酸二甲酯,嚴重威脅消費者的身體健康。高效液相色譜法因具有測定成本低、操作簡單、快速、準確等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于食品檢測中。本文對樣品前處理進行單因素優(yōu)化,并建立高效液相色譜法測定乳制品中富馬酸二甲酯,為相關(guān)部門對乳制品的質(zhì)量監(jiān)控提供參考,也為人們能喝上優(yōu)質(zhì)的乳制品提供保障。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
材料。牛奶樣品1號、5號、7號、8號、9號購自寧夏夏進科技股份有限公司,牛奶樣品2號購自寧夏春天然乳品股份有限公司,牛奶樣品3號、4號購自寧夏塞上乳業(yè)股份有限公司,牛奶樣品6號購自寧夏銀川平吉堡乳業(yè)廠;甲醇、乙酸為色譜純,購自賽默飛試劑有限公司;鹽酸、乙酸鈉、溴化四丁基銨、氨水均為分析純,購自國藥集團化學試劑有限公司;富馬酸二甲酯標準品[(DAKKS(德國進口)],純度99.9%。
儀器。高效液相色譜儀(型號:LC-20AT/SPD-M20A,二極管陣列檢測器,日本島津公司);紫外/可見分光光度計(型號:TU-1810,普析通用儀器有限責任公司);電子天平[型號:MS-105,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司];離心機(型號:TGL-16G,上海安亭科學儀器廠);超聲波清洗器(型號:AS3120,天津奧特恩斯儀器有限公司);過濾真空泵(型號:AP-9925-3,天津奧特恩斯儀器有限公司)。
1.2 色譜條件
WondaSil C18(4.6 mm×250 mm,5 μ m)色譜柱;甲醇∶緩沖溶液(55∶45)為流動相;流速1.0 mL·min-1;檢測波長280 nm;柱溫40 ℃;進樣量20 L。
1.3 試驗方法
1.3.1 標準曲線的繪制
準確移收富馬酸二甲酯儲備液(1.0 mg·mL-1)0.1、0.2、0.5、1.0 mL和2.0 mL于10 mL容量瓶中,制備標準系列10、20、50、100 μ g·mL-1和200 μ g·mL-1標準工作液。以標準系列溶液濃度為橫坐標,以峰面積為縱坐標,繪制標準曲線。
1.3.2 樣品的前處理方法建立
準確稱取乳制品3 g于50 mL比色管中,加入10 mL氨水甲醇溶液(1∶20),振蕩搖勻,超聲15 min,待冷卻到室溫后,加入鹽酸,調(diào)節(jié)pH至6.0,用水定容至25 mL。靜置,取部分上清液于離心管中,加入沉淀劑(乙酸鋅和亞鐵氰化鉀各3~5滴),5 000 r·min-1離心5 min。取上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾,備用。
2 結(jié)果與分析
2.1 檢測波長的確定
由圖1知,富馬酸二甲酯在280 nm處具有最大吸收峰,因此,選擇280 nm作為檢測波長。
2.2 色譜條件的選擇
2.2.1 色譜柱的選擇
由圖2知,WondaSil C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱分離度比WondaSil C18 (4.6 mm×150 mm,5 μm)更高。乳制品中含有較多雜質(zhì)和大量蛋白質(zhì),所以本次選用WondaSil C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)作為本次試驗的色譜柱。
2.2.2 流動相的確定
由圖3知,當流動相為甲醇∶水(55∶45)和乙腈∶水(60∶40)時,未檢測出富馬酸二甲酯,乙腈∶磷酸(10∶90)的富馬酸二甲酯峰與溶劑峰相比較,富馬酸二甲酯的峰太小不易分辨,而流動相甲醇∶緩沖溶液(55∶45)的目標峰與溶劑中干擾峰完全分離,色譜峰突出。選擇甲醇∶緩沖溶液(55∶45)為本次實驗流動相。
2.2.3 柱溫的確定
在280 nm波長、WondaSil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)、甲醇∶緩沖溶液(55∶45)流動相及柱溫40 ℃條件下,標樣和樣品均具有較好的分離度,故確定本次試驗的柱溫為40 ℃(見圖4)。
2.3 定性實驗
在280 nm波長、WondaSil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)及甲醇∶緩沖溶液(55∶45)流動相、40 ℃柱溫條件下,做定性實驗。如圖5所示,樣品富馬酸二甲酯的保留時間與標準品保留時間一致,且分離度符合要求。
2.4 標準曲線的繪制
由圖6標準曲線圖可知,回歸方程為A=271 924X-80 426.4,R2=0.999 9。富馬酸二甲酯濃度在10~200 μg·mL-1范圍內(nèi)與其響應(yīng)值呈良好的線性關(guān)系。
2.5 樣品的前處理單因素優(yōu)化試驗
分別以提取溶液、超聲時間、離心轉(zhuǎn)速、pH值等對乳制品中富馬酸二甲酯回收率產(chǎn)生影響的幾個因素作單因素試驗,以各因素值為橫坐標,回收率為縱坐標,繪制散點趨勢圖,考察各因素的變化與富馬酸二甲酯加標回收率的關(guān)系
2.5.1 提取溶液的確定
選取不同提取溶液,氨水∶甲醇(1∶20)、甲醇、乙腈、氨水進行試驗。按照1.3.2處理,研究提取溶液對富馬酸二甲酯回收率的影響。如圖7所示,當提取溶液為氨水甲醇(1∶20)時,測出的富馬酸二甲酯的回收率最大,甲醇和乙腈溶液測得的回收率相對較少,氨水溶液沒有測得回收率。所以試驗最終選擇提取溶液為氨水∶甲醇(1∶20)。
2.5.2 超聲時間的確定
選取超聲時間5、15、25、35、45 min和60 min為試驗對象,按照1.3.2處理,研究不同超聲時間對富馬酸二甲酯回收率的影響。如圖8所示,試驗結(jié)果顯示超聲5~15 min,隨超聲時間的增加富馬酸二甲酯的回收率上升,15~35 min回收率較為平穩(wěn)。35~60 min開始下降。選取15 min為本次試驗的超聲時間。
2.5.3 離心機轉(zhuǎn)速的確定
選取1 000、3 000、5 000、7 000、9 000 r·min-1和10 000 r·min-1離心轉(zhuǎn)速進行試驗,按照1.3.2處理,研究不同轉(zhuǎn)速對富馬酸二甲酯回收率的影響。由圖9試驗結(jié)果顯示,1 000~5 000 r·min-1回收率逐步增大,5 000~9 000 r·min-1回收率逐步降低,9 000~10 000 r·min-1回收率又逐步升高。5 000 r·min-1回收率最大。選擇5 000 r·min-1作為本次實驗的離心機轉(zhuǎn)速。
2.5.4 pH值的確定
試驗選取pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0為試驗對象,按照1.3.2處理,考察不同pH值對富馬酸二甲酯回收率的影響。如圖10所示,pH值為6.0時回收率最高,選擇pH值為6.0。
2.6 穩(wěn)定性試驗
由表1知,12 d內(nèi)的RSD值為1.87%,可以在0~4 ℃避光冷藏保存12 d。
2.7 精密度試驗
在已確定的色譜條件下,準確吸取富馬酸二甲酯標準溶液100 μg·mL-1共6份,每份吸取0.5 mL標準溶液,測定結(jié)果見表2。RSD平均值為0.053%,小于2%,表明精度良好。
2.8 檢出限及定量限試驗
吸取富馬酸二甲酯標準溶液100(μg·mL-1)測定,在儀器的響應(yīng)值是儀器噪聲的3倍時,計算最小檢出限,儀器的響應(yīng)值是儀器噪聲的10倍時,計算定量限。
2.9 加標回收率試驗
準確稱取6份6#平吉堡酸牛奶樣品,加入100 μg·mL-1富馬酸二甲酯標準液2.00、2.50、3.00 mL各2份,按照1.3.2方法處理。計算加標回收率。由表4所示,加標平均回收率為102.05%,RSD為0.25%。
2.10 樣品測定
對市場上銷售的乳制品按照所建立方法進行測定,均未檢測出富馬酸二甲酯,實驗結(jié)果如表5所示。
1~9號乳制品中富馬酸二甲酯的添加量符合國家相關(guān)限度標準的規(guī)定,合格率為100%。
3 結(jié)論
本文通過單因素試驗對乳制品前處理方法進行優(yōu)化,與標準前處理方法相比具有更高的加標回收率;采用HPLC法測定乳制品中富馬酸二甲酯的含量,該方法線性關(guān)系良好,檢出限、定量限低,平均回收率高。可用于乳制品中大批量富馬酸二甲酯的測定。
參考文獻:
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