HPLC法測(cè)定乳制品中富馬酸二甲酯的方法學(xué)研究

李順紅　黃鳳玲　賀曉光

摘 要：本實(shí)驗(yàn)建立了高效液相色譜法測(cè)定乳制品中富馬酸二甲酯。檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm， WondaSil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-緩沖溶液（55∶45），柱溫40 ℃。氨水甲醇溶液作為提取劑、超聲15 min、轉(zhuǎn)速5 000 r·min-1、pH值6.0條件下測(cè)得富馬酸二甲酯回收率最高，檢出限為0.60 μg·mL-1，定量限為1.82 μg·mL-1，平均回收率102.05%，精密度RSD為0.053%，該方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，適用于乳制品中富馬酸二甲酯檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：乳制品;富馬酸二甲酯;提取條件;高效液相色譜法

Abstract：A high performance liquid chromatography （HPLC） was established for the determination of dimethyl fumarate in dairy products. The detection wavelength was 280 nm， WondaSil C18 Chromatographic column （4.6 mm×250 mm，

5 μm）. The mobile phase was methanol-Buffer solution （55∶45）， and the column temperature was 40 ℃. The recovery of dimethyl fumarate was the highest under the condition of ammonia water methanol solution as extractant， ultrasound for

15 min， rotating speed of 5 000 r·min-1 and pH value of 6.0.The detection limit was 0.60 μ g·mL-1， the quantitative limit was 1.82 μg·mL-1， the average recovery was 102.05%， and the precision RSD was 0.053%.The method is simple， rapid and accurate， and is suitable for the detection of dimethyl fumarate in dairy products.

Key words：Dairy products; Dimethyl fumarate; Extraction conditions; HPLC.

中圖分類號(hào)：TS252.7

富馬酸二甲酯（DMF）是一種新型抗菌劑和防霉劑，又稱霉敵。由于富馬酸二甲酯對(duì)抑制霉菌、酵母菌和細(xì)菌的生長(zhǎng)有顯著效果[1]，抗菌活性幾乎不受pH影響，對(duì)乳制品的防霉效果優(yōu)于丙酸鹽、山梨酸及雙乙酸鈉等酸性防腐劑，因而被廣泛應(yīng)用于乳制品、蔬菜、面粉、熟食、飼料及化妝品中用于防霉[2]。在常溫下，富馬酸二甲酯易升華，對(duì)人的眼睛、呼吸系統(tǒng)和黏膜有刺激作用，它可在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成甲醇，對(duì)腸道、內(nèi)臟等器官有毒副作用，尤其對(duì)兒童的成長(zhǎng)發(fā)育危害極大[3]。

我國(guó)衛(wèi)生部禁止在食品中添加富馬酸二甲酯[4]。一些不法食品生產(chǎn)者為降低成本、延長(zhǎng)產(chǎn)品保質(zhì)期，仍然在乳制品中違法使用富馬酸二甲酯，嚴(yán)重威脅消費(fèi)者的身體健康。高效液相色譜法因具有測(cè)定成本低、操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于食品檢測(cè)中。本文對(duì)樣品前處理進(jìn)行單因素優(yōu)化，并建立高效液相色譜法測(cè)定乳制品中富馬酸二甲酯，為相關(guān)部門對(duì)乳制品的質(zhì)量監(jiān)控提供參考，也為人們能喝上優(yōu)質(zhì)的乳制品提供保障。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料。牛奶樣品1號(hào)、5號(hào)、7號(hào)、8號(hào)、9號(hào)購(gòu)自寧夏夏進(jìn)科技股份有限公司，牛奶樣品2號(hào)購(gòu)自寧夏春天然乳品股份有限公司，牛奶樣品3號(hào)、4號(hào)購(gòu)自寧夏塞上乳業(yè)股份有限公司，牛奶樣品6號(hào)購(gòu)自寧夏銀川平吉堡乳業(yè)廠;甲醇、乙酸為色譜純，購(gòu)自賽默飛試劑有限公司;鹽酸、乙酸鈉、溴化四丁基銨、氨水均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;富馬酸二甲酯標(biāo)準(zhǔn)品[（DAKKS（德國(guó)進(jìn)口）]，純度99.9%。

儀器。高效液相色譜儀（型號(hào)：LC-20AT/SPD-M20A，二極管陣列檢測(cè)器，日本島津公司）;紫外/可見分光光度計(jì)（型號(hào)：TU-1810，普析通用儀器有限責(zé)任公司）;電子天平[型號(hào)：MS-105，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司];離心機(jī)（型號(hào)：TGL-16G，上海安亭科學(xué)儀器廠）;超聲波清洗器（型號(hào)：AS3120，天津奧特恩斯儀器有限公司）;過濾真空泵（型號(hào)：AP-9925-3，天津奧特恩斯儀器有限公司）。

1.2 色譜條件

WondaSil C18（4.6 mm×250 mm，5 μ m）色譜柱;甲醇∶緩沖溶液（55∶45）為流動(dòng)相;流速1.0 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量20 L。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確移收富馬酸二甲酯儲(chǔ)備液（1.0 mg·mL-1）0.1、0.2、0.5、1.0 mL和2.0 mL于10 mL容量瓶中，制備標(biāo)準(zhǔn)系列10、20、50、100 μ g·mL-1和200 μ g·mL-1標(biāo)準(zhǔn)工作液。以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 樣品的前處理方法建立

準(zhǔn)確稱取乳制品3 g于50 mL比色管中，加入10 mL氨水甲醇溶液（1∶20），振蕩搖勻，超聲15 min，待冷卻到室溫后，加入鹽酸，調(diào)節(jié)pH至6.0，用水定容至25 mL。靜置，取部分上清液于離心管中，加入沉淀劑（乙酸鋅和亞鐵氰化鉀各3～5滴），5 000 r·min-1離心5 min。取上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

由圖1知，富馬酸二甲酯在280 nm處具有最大吸收峰，因此，選擇280 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 色譜柱的選擇

由圖2知，WondaSil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱分離度比WondaSil C18 （4.6 mm×150 mm，5 μm）更高。乳制品中含有較多雜質(zhì)和大量蛋白質(zhì)，所以本次選用WondaSil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）作為本次試驗(yàn)的色譜柱。

2.2.2 流動(dòng)相的確定

由圖3知，當(dāng)流動(dòng)相為甲醇∶水（55∶45）和乙腈∶水（60∶40）時(shí)，未檢測(cè)出富馬酸二甲酯，乙腈∶磷酸（10∶90）的富馬酸二甲酯峰與溶劑峰相比較，富馬酸二甲酯的峰太小不易分辨，而流動(dòng)相甲醇∶緩沖溶液（55∶45）的目標(biāo)峰與溶劑中干擾峰完全分離，色譜峰突出。選擇甲醇∶緩沖溶液（55∶45）為本次實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相。

2.2.3 柱溫的確定

在280 nm波長(zhǎng)、WondaSil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、甲醇∶緩沖溶液（55∶45）流動(dòng)相及柱溫40 ℃條件下，標(biāo)樣和樣品均具有較好的分離度，故確定本次試驗(yàn)的柱溫為40 ℃（見圖4）。

2.3 定性實(shí)驗(yàn)

在280 nm波長(zhǎng)、WondaSil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）及甲醇∶緩沖溶液（55∶45）流動(dòng)相、40 ℃柱溫條件下，做定性實(shí)驗(yàn)。如圖5所示，樣品富馬酸二甲酯的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間一致，且分離度符合要求。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

由圖6標(biāo)準(zhǔn)曲線圖可知，回歸方程為A=271 924X-80 426.4，R2=0.999 9。富馬酸二甲酯濃度在10～200 μg·mL-1范圍內(nèi)與其響應(yīng)值呈良好的線性關(guān)系。

2.5 樣品的前處理單因素優(yōu)化試驗(yàn)

分別以提取溶液、超聲時(shí)間、離心轉(zhuǎn)速、pH值等對(duì)乳制品中富馬酸二甲酯回收率產(chǎn)生影響的幾個(gè)因素作單因素試驗(yàn)，以各因素值為橫坐標(biāo)，回收率為縱坐標(biāo)，繪制散點(diǎn)趨勢(shì)圖，考察各因素的變化與富馬酸二甲酯加標(biāo)回收率的關(guān)系

2.5.1 提取溶液的確定

選取不同提取溶液，氨水∶甲醇（1∶20）、甲醇、乙腈、氨水進(jìn)行試驗(yàn)。按照1.3.2處理，研究提取溶液對(duì)富馬酸二甲酯回收率的影響。如圖7所示，當(dāng)提取溶液為氨水甲醇（1∶20）時(shí)，測(cè)出的富馬酸二甲酯的回收率最大，甲醇和乙腈溶液測(cè)得的回收率相對(duì)較少，氨水溶液沒有測(cè)得回收率。所以試驗(yàn)最終選擇提取溶液為氨水∶甲醇（1∶20）。

2.5.2 超聲時(shí)間的確定

選取超聲時(shí)間5、15、25、35、45 min和60 min為試驗(yàn)對(duì)象，按照1.3.2處理，研究不同超聲時(shí)間對(duì)富馬酸二甲酯回收率的影響。如圖8所示，試驗(yàn)結(jié)果顯示超聲5～15 min，隨超聲時(shí)間的增加富馬酸二甲酯的回收率上升，15～35 min回收率較為平穩(wěn)。35～60 min開始下降。選取15 min為本次試驗(yàn)的超聲時(shí)間。

2.5.3 離心機(jī)轉(zhuǎn)速的確定

選取1 000、3 000、5 000、7 000、9 000 r·min-1和10 000 r·min-1離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行試驗(yàn)，按照1.3.2處理，研究不同轉(zhuǎn)速對(duì)富馬酸二甲酯回收率的影響。由圖9試驗(yàn)結(jié)果顯示，1 000～5 000 r·min-1回收率逐步增大，5 000～9 000 r·min-1回收率逐步降低，9 000～10 000 r·min-1回收率又逐步升高。5 000 r·min-1回收率最大。選擇5 000 r·min-1作為本次實(shí)驗(yàn)的離心機(jī)轉(zhuǎn)速。

2.5.4 pH值的確定

試驗(yàn)選取pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0為試驗(yàn)對(duì)象，按照1.3.2處理，考察不同pH值對(duì)富馬酸二甲酯回收率的影響。如圖10所示，pH值為6.0時(shí)回收率最高，選擇pH值為6.0。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

由表1知，12 d內(nèi)的RSD值為1.87%，可以在0～4 ℃避光冷藏保存12 d。

2.7 精密度試驗(yàn)

在已確定的色譜條件下，準(zhǔn)確吸取富馬酸二甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μg·mL-1共6份，每份吸取0.5 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定結(jié)果見表2。RSD平均值為0.053%，小于2%，表明精度良好。

2.8 檢出限及定量限試驗(yàn)

吸取富馬酸二甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液100（μg·mL-1）測(cè)定，在儀器的響應(yīng)值是儀器噪聲的3倍時(shí)，計(jì)算最小檢出限，儀器的響應(yīng)值是儀器噪聲的10倍時(shí)，計(jì)算定量限。

2.9 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取6份6#平吉堡酸牛奶樣品，加入100 μg·mL-1富馬酸二甲酯標(biāo)準(zhǔn)液2.00、2.50、3.00 mL各2份，按照1.3.2方法處理。計(jì)算加標(biāo)回收率。由表4所示，加標(biāo)平均回收率為102.05%，RSD為0.25%。

2.10 樣品測(cè)定

對(duì)市場(chǎng)上銷售的乳制品按照所建立方法進(jìn)行測(cè)定，均未檢測(cè)出富馬酸二甲酯，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示。

1～9號(hào)乳制品中富馬酸二甲酯的添加量符合國(guó)家相關(guān)限度標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，合格率為100%。

3 結(jié)論

本文通過單因素試驗(yàn)對(duì)乳制品前處理方法進(jìn)行優(yōu)化，與標(biāo)準(zhǔn)前處理方法相比具有更高的加標(biāo)回收率;采用HPLC法測(cè)定乳制品中富馬酸二甲酯的含量，該方法線性關(guān)系良好，檢出限、定量限低，平均回收率高。可用于乳制品中大批量富馬酸二甲酯的測(cè)定。

參考文獻(xiàn)：

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