HPLC法測定乳制品中富馬酸二甲酯的方法學研究

李順紅　黃鳳玲　賀曉光

摘 要：本實驗建立了高效液相色譜法測定乳制品中富馬酸二甲酯。檢測波長為280 nm， WondaSil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為甲醇-緩沖溶液（55∶45），柱溫40 ℃。氨水甲醇溶液作為提取劑、超聲15 min、轉(zhuǎn)速5 000 r·min-1、pH值6.0條件下測得富馬酸二甲酯回收率最高，檢出限為0.60 μg·mL-1，定量限為1.82 μg·mL-1，平均回收率102.05%，精密度RSD為0.053%，該方法簡單、快速、準確，適用于乳制品中富馬酸二甲酯檢測。

關(guān)鍵詞：乳制品;富馬酸二甲酯;提取條件;高效液相色譜法

Abstract：A high performance liquid chromatography （HPLC） was established for the determination of dimethyl fumarate in dairy products. The detection wavelength was 280 nm， WondaSil C18 Chromatographic column （4.6 mm×250 mm，

5 μm）. The mobile phase was methanol-Buffer solution （55∶45）， and the column temperature was 40 ℃. The recovery of dimethyl fumarate was the highest under the condition of ammonia water methanol solution as extractant， ultrasound for

15 min， rotating speed of 5 000 r·min-1 and pH value of 6.0.The detection limit was 0.60 μ g·mL-1， the quantitative limit was 1.82 μg·mL-1， the average recovery was 102.05%， and the precision RSD was 0.053%.The method is simple， rapid and accurate， and is suitable for the detection of dimethyl fumarate in dairy products.

Key words：Dairy products; Dimethyl fumarate; Extraction conditions; HPLC.

中圖分類號：TS252.7

富馬酸二甲酯（DMF）是一種新型抗菌劑和防霉劑，又稱霉敵。由于富馬酸二甲酯對抑制霉菌、酵母菌和細菌的生長有顯著效果[1]，抗菌活性幾乎不受pH影響，對乳制品的防霉效果優(yōu)于丙酸鹽、山梨酸及雙乙酸鈉等酸性防腐劑，因而被廣泛應(yīng)用于乳制品、蔬菜、面粉、熟食、飼料及化妝品中用于防霉[2]。在常溫下，富馬酸二甲酯易升華，對人的眼睛、呼吸系統(tǒng)和黏膜有刺激作用，它可在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成甲醇，對腸道、內(nèi)臟等器官有毒副作用，尤其對兒童的成長發(fā)育危害極大[3]。

我國衛(wèi)生部禁止在食品中添加富馬酸二甲酯[4]。一些不法食品生產(chǎn)者為降低成本、延長產(chǎn)品保質(zhì)期，仍然在乳制品中違法使用富馬酸二甲酯，嚴重威脅消費者的身體健康。高效液相色譜法因具有測定成本低、操作簡單、快速、準確等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于食品檢測中。本文對樣品前處理進行單因素優(yōu)化，并建立高效液相色譜法測定乳制品中富馬酸二甲酯，為相關(guān)部門對乳制品的質(zhì)量監(jiān)控提供參考，也為人們能喝上優(yōu)質(zhì)的乳制品提供保障。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料。牛奶樣品1號、5號、7號、8號、9號購自寧夏夏進科技股份有限公司，牛奶樣品2號購自寧夏春天然乳品股份有限公司，牛奶樣品3號、4號購自寧夏塞上乳業(yè)股份有限公司，牛奶樣品6號購自寧夏銀川平吉堡乳業(yè)廠;甲醇、乙酸為色譜純，購自賽默飛試劑有限公司;鹽酸、乙酸鈉、溴化四丁基銨、氨水均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司;富馬酸二甲酯標準品[（DAKKS（德國進口）]，純度99.9%。

儀器。高效液相色譜儀（型號：LC-20AT/SPD-M20A，二極管陣列檢測器，日本島津公司）;紫外/可見分光光度計（型號：TU-1810，普析通用儀器有限責任公司）;電子天平[型號：MS-105，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司];離心機（型號：TGL-16G，上海安亭科學儀器廠）;超聲波清洗器（型號：AS3120，天津奧特恩斯儀器有限公司）;過濾真空泵（型號：AP-9925-3，天津奧特恩斯儀器有限公司）。

1.2 色譜條件

WondaSil C18（4.6 mm×250 mm，5 μ m）色譜柱;甲醇∶緩沖溶液（55∶45）為流動相;流速1.0 mL·min-1;檢測波長280 nm;柱溫40 ℃;進樣量20 L。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準曲線的繪制

準確移收富馬酸二甲酯儲備液（1.0 mg·mL-1）0.1、0.2、0.5、1.0 mL和2.0 mL于10 mL容量瓶中，制備標準系列10、20、50、100 μ g·mL-1和200 μ g·mL-1標準工作液。以標準系列溶液濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.2 樣品的前處理方法建立

準確稱取乳制品3 g于50 mL比色管中，加入10 mL氨水甲醇溶液（1∶20），振蕩搖勻，超聲15 min，待冷卻到室溫后，加入鹽酸，調(diào)節(jié)pH至6.0，用水定容至25 mL。靜置，取部分上清液于離心管中，加入沉淀劑（乙酸鋅和亞鐵氰化鉀各3～5滴），5 000 r·min-1離心5 min。取上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長的確定

由圖1知，富馬酸二甲酯在280 nm處具有最大吸收峰，因此，選擇280 nm作為檢測波長。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 色譜柱的選擇

由圖2知，WondaSil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱分離度比WondaSil C18 （4.6 mm×150 mm，5 μm）更高。乳制品中含有較多雜質(zhì)和大量蛋白質(zhì)，所以本次選用WondaSil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）作為本次試驗的色譜柱。

2.2.2 流動相的確定

由圖3知，當流動相為甲醇∶水（55∶45）和乙腈∶水（60∶40）時，未檢測出富馬酸二甲酯，乙腈∶磷酸（10∶90）的富馬酸二甲酯峰與溶劑峰相比較，富馬酸二甲酯的峰太小不易分辨，而流動相甲醇∶緩沖溶液（55∶45）的目標峰與溶劑中干擾峰完全分離，色譜峰突出。選擇甲醇∶緩沖溶液（55∶45）為本次實驗流動相。

2.2.3 柱溫的確定

在280 nm波長、WondaSil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、甲醇∶緩沖溶液（55∶45）流動相及柱溫40 ℃條件下，標樣和樣品均具有較好的分離度，故確定本次試驗的柱溫為40 ℃（見圖4）。

2.3 定性實驗

在280 nm波長、WondaSil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）及甲醇∶緩沖溶液（55∶45）流動相、40 ℃柱溫條件下，做定性實驗。如圖5所示，樣品富馬酸二甲酯的保留時間與標準品保留時間一致，且分離度符合要求。

2.4 標準曲線的繪制

由圖6標準曲線圖可知，回歸方程為A=271 924X-80 426.4，R2=0.999 9。富馬酸二甲酯濃度在10～200 μg·mL-1范圍內(nèi)與其響應(yīng)值呈良好的線性關(guān)系。

2.5 樣品的前處理單因素優(yōu)化試驗

分別以提取溶液、超聲時間、離心轉(zhuǎn)速、pH值等對乳制品中富馬酸二甲酯回收率產(chǎn)生影響的幾個因素作單因素試驗，以各因素值為橫坐標，回收率為縱坐標，繪制散點趨勢圖，考察各因素的變化與富馬酸二甲酯加標回收率的關(guān)系

2.5.1 提取溶液的確定

選取不同提取溶液，氨水∶甲醇（1∶20）、甲醇、乙腈、氨水進行試驗。按照1.3.2處理，研究提取溶液對富馬酸二甲酯回收率的影響。如圖7所示，當提取溶液為氨水甲醇（1∶20）時，測出的富馬酸二甲酯的回收率最大，甲醇和乙腈溶液測得的回收率相對較少，氨水溶液沒有測得回收率。所以試驗最終選擇提取溶液為氨水∶甲醇（1∶20）。

2.5.2 超聲時間的確定

選取超聲時間5、15、25、35、45 min和60 min為試驗對象，按照1.3.2處理，研究不同超聲時間對富馬酸二甲酯回收率的影響。如圖8所示，試驗結(jié)果顯示超聲5～15 min，隨超聲時間的增加富馬酸二甲酯的回收率上升，15～35 min回收率較為平穩(wěn)。35～60 min開始下降。選取15 min為本次試驗的超聲時間。

2.5.3 離心機轉(zhuǎn)速的確定

選取1 000、3 000、5 000、7 000、9 000 r·min-1和10 000 r·min-1離心轉(zhuǎn)速進行試驗，按照1.3.2處理，研究不同轉(zhuǎn)速對富馬酸二甲酯回收率的影響。由圖9試驗結(jié)果顯示，1 000～5 000 r·min-1回收率逐步增大，5 000～9 000 r·min-1回收率逐步降低，9 000～10 000 r·min-1回收率又逐步升高。5 000 r·min-1回收率最大。選擇5 000 r·min-1作為本次實驗的離心機轉(zhuǎn)速。

2.5.4 pH值的確定

試驗選取pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0為試驗對象，按照1.3.2處理，考察不同pH值對富馬酸二甲酯回收率的影響。如圖10所示，pH值為6.0時回收率最高，選擇pH值為6.0。

2.6 穩(wěn)定性試驗

由表1知，12 d內(nèi)的RSD值為1.87%，可以在0～4 ℃避光冷藏保存12 d。

2.7 精密度試驗

在已確定的色譜條件下，準確吸取富馬酸二甲酯標準溶液100 μg·mL-1共6份，每份吸取0.5 mL標準溶液，測定結(jié)果見表2。RSD平均值為0.053%，小于2%，表明精度良好。

2.8 檢出限及定量限試驗

吸取富馬酸二甲酯標準溶液100（μg·mL-1）測定，在儀器的響應(yīng)值是儀器噪聲的3倍時，計算最小檢出限，儀器的響應(yīng)值是儀器噪聲的10倍時，計算定量限。

2.9 加標回收率試驗

準確稱取6份6#平吉堡酸牛奶樣品，加入100 μg·mL-1富馬酸二甲酯標準液2.00、2.50、3.00 mL各2份，按照1.3.2方法處理。計算加標回收率。由表4所示，加標平均回收率為102.05%，RSD為0.25%。

2.10 樣品測定

對市場上銷售的乳制品按照所建立方法進行測定，均未檢測出富馬酸二甲酯，實驗結(jié)果如表5所示。

1～9號乳制品中富馬酸二甲酯的添加量符合國家相關(guān)限度標準的規(guī)定，合格率為100%。

3 結(jié)論

本文通過單因素試驗對乳制品前處理方法進行優(yōu)化，與標準前處理方法相比具有更高的加標回收率;采用HPLC法測定乳制品中富馬酸二甲酯的含量，該方法線性關(guān)系良好，檢出限、定量限低，平均回收率高。可用于乳制品中大批量富馬酸二甲酯的測定。

參考文獻：

[1]官詠儀，邱志超，金 夢，等.高效液相色譜法同時測定食品中納他霉素和富馬酸二甲酯的含量[J].食品安全質(zhì)量檢測學報，2017，8（6）：2246-2250.

[2]龐艷蘋，趙志磊，吳廣臣，等.高效液相色譜法測定面制品中富馬酸二甲酯的含量[J].食品工業(yè)科技，2009，30（9）：311，352.

[3]鄒 潔，張 征，顏春榮，等.GPC-GC-MS測定糕點和麻辣食品中的富馬酸二甲酯[J].食品科學，2011，32（24）：267-269.

[4]全國食品安全整頓辦公室.食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)名單（第二批[EB/OL].（2009-02-04）[2019-12-01].http：//law.foodmate.net/show-180881.html.