HPLC法測定乳制品中富馬酸二甲酯的方法學研究

李順紅　黃鳳玲　賀曉光

摘 要：本實驗建立了高效液相色譜法測定乳制品中富馬酸二甲酯。檢測波長為280 nm， WondaSil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為甲醇-緩沖溶液（55∶45），柱溫40 ℃。氨水甲醇溶液作為提取劑、超聲15 min、轉速5 000 r·min-1、pH值6.0條件下測得富馬酸二甲酯回收率最高，檢出限為0.60 μg·mL-1，定量限為1.82 μg·mL-1，平均回收率102.05%，精密度RSD為0.053%，該方法簡單、快速、準確，適用于乳制品中富馬酸二甲酯檢測。

關鍵詞：乳制品;富馬酸二甲酯;提取條件;高效液相色譜法

Abstract：A high performance liquid chromatography （HPLC） was established for the determination of dimethyl fumarate in dairy products. The detection wavelength was 280 nm， WondaSil C18 Chromatographic column （4.6 mm×250 mm，

5 μm）. The mobile phase was methanol-Buffer solution （55∶45）， and the column temperature was 40 ℃. The recovery of dimethyl fumarate was the highest under the condition of ammonia water methanol solution as extractant， ultrasound for

15 min， rotating speed of 5 000 r·min-1 and pH value of 6.0.The detection limit was 0.60 μ g·mL-1， the quantitative limit was 1.82 μg·mL-1， the average recovery was 102.05%， and the precision RSD was 0.053%.The method is simple， rapid and accurate， and is suitable for the detection of dimethyl fumarate in dairy products.

Key words：Dairy products; Dimethyl fumarate; Extraction conditions; HPLC.

中圖分類號：TS252.7

富馬酸二甲酯（DMF）是一種新型抗菌劑和防霉劑，又稱霉敵。由于富馬酸二甲酯對抑制霉菌、酵母菌和細菌的生長有顯著效果[1]，抗菌活性幾乎不受pH影響，對乳制品的防霉效果優于丙酸鹽、山梨酸及雙乙酸鈉等酸性防腐劑，因而被廣泛應用于乳制品、蔬菜、面粉、熟食、飼料及化妝品中用于防霉[2]。在常溫下，富馬酸二甲酯易升華，對人的眼睛、呼吸系統和黏膜有刺激作用，它可在體內轉化成甲醇，對腸道、內臟等器官有毒副作用，尤其對兒童的成長發育危害極大[3]。

我國衛生部禁止在食品中添加富馬酸二甲酯[4]。一些不法食品生產者為降低成本、延長產品保質期，仍然在乳制品中違法使用富馬酸二甲酯，嚴重威脅消費者的身體健康。高效液相色譜法因具有測定成本低、操作簡單、快速、準確等優點被廣泛應用于食品檢測中。本文對樣品前處理進行單因素優化，并建立高效液相色譜法測定乳制品中富馬酸二甲酯，為相關部門對乳制品的質量監控提供參考，也為人們能喝上優質的乳制品提供保障。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料。牛奶樣品1號、5號、7號、8號、9號購自寧夏夏進科技股份有限公司，牛奶樣品2號購自寧夏春天然乳品股份有限公司，牛奶樣品3號、4號購自寧夏塞上乳業股份有限公司，牛奶樣品6號購自寧夏銀川平吉堡乳業廠;甲醇、乙酸為色譜純，購自賽默飛試劑有限公司;鹽酸、乙酸鈉、溴化四丁基銨、氨水均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司;富馬酸二甲酯標準品[（DAKKS（德國進口）]，純度99.9%。

儀器。高效液相色譜儀（型號：LC-20AT/SPD-M20A，二極管陣列檢測器，日本島津公司）;紫外/可見分光光度計（型號：TU-1810，普析通用儀器有限責任公司）;電子天平[型號：MS-105，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司];離心機（型號：TGL-16G，上海安亭科學儀器廠）;超聲波清洗器（型號：AS3120，天津奧特恩斯儀器有限公司）;過濾真空泵（型號：AP-9925-3，天津奧特恩斯儀器有限公司）。

1.2 色譜條件

WondaSil C18（4.6 mm×250 mm，5 μ m）色譜柱;甲醇∶緩沖溶液（55∶45）為流動相;流速1.0 mL·min-1;檢測波長280 nm;柱溫40 ℃;進樣量20 L。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準曲線的繪制

準確移收富馬酸二甲酯儲備液（1.0 mg·mL-1）0.1、0.2、0.5、1.0 mL和2.0 mL于10 mL容量瓶中，制備標準系列10、20、50、100 μ g·mL-1和200 μ g·mL-1標準工作液。以標準系列溶液濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.2 樣品的前處理方法建立

準確稱取乳制品3 g于50 mL比色管中，加入10 mL氨水甲醇溶液（1∶20），振蕩搖勻，超聲15 min，待冷卻到室溫后，加入鹽酸，調節pH至6.0，用水定容至25 mL。靜置，取部分上清液于離心管中，加入沉淀劑（乙酸鋅和亞鐵氰化鉀各3～5滴），5 000 r·min-1離心5 min。取上清液經0.45 μm濾膜過濾，備用。

2 結果與分析

2.1 檢測波長的確定

由圖1知，富馬酸二甲酯在280 nm處具有最大吸收峰，因此，選擇280 nm作為檢測波長。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 色譜柱的選擇

由圖2知，WondaSil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱分離度比WondaSil C18 （4.6 mm×150 mm，5 μm）更高。乳制品中含有較多雜質和大量蛋白質，所以本次選用WondaSil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）作為本次試驗的色譜柱。

2.2.2 流動相的確定

由圖3知，當流動相為甲醇∶水（55∶45）和乙腈∶水（60∶40）時，未檢測出富馬酸二甲酯，乙腈∶磷酸（10∶90）的富馬酸二甲酯峰與溶劑峰相比較，富馬酸二甲酯的峰太小不易分辨，而流動相甲醇∶緩沖溶液（55∶45）的目標峰與溶劑中干擾峰完全分離，色譜峰突出。選擇甲醇∶緩沖溶液（55∶45）為本次實驗流動相。

2.2.3 柱溫的確定

在280 nm波長、WondaSil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、甲醇∶緩沖溶液（55∶45）流動相及柱溫40 ℃條件下，標樣和樣品均具有較好的分離度，故確定本次試驗的柱溫為40 ℃（見圖4）。

2.3 定性實驗

在280 nm波長、WondaSil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）及甲醇∶緩沖溶液（55∶45）流動相、40 ℃柱溫條件下，做定性實驗。如圖5所示，樣品富馬酸二甲酯的保留時間與標準品保留時間一致，且分離度符合要求。

2.4 標準曲線的繪制

由圖6標準曲線圖可知，回歸方程為A=271 924X-80 426.4，R2=0.999 9。富馬酸二甲酯濃度在10～200 μg·mL-1范圍內與其響應值呈良好的線性關系。

2.5 樣品的前處理單因素優化試驗

分別以提取溶液、超聲時間、離心轉速、pH值等對乳制品中富馬酸二甲酯回收率產生影響的幾個因素作單因素試驗，以各因素值為橫坐標，回收率為縱坐標，繪制散點趨勢圖，考察各因素的變化與富馬酸二甲酯加標回收率的關系

2.5.1 提取溶液的確定

選取不同提取溶液，氨水∶甲醇（1∶20）、甲醇、乙腈、氨水進行試驗。按照1.3.2處理，研究提取溶液對富馬酸二甲酯回收率的影響。如圖7所示，當提取溶液為氨水甲醇（1∶20）時，測出的富馬酸二甲酯的回收率最大，甲醇和乙腈溶液測得的回收率相對較少，氨水溶液沒有測得回收率。所以試驗最終選擇提取溶液為氨水∶甲醇（1∶20）。

2.5.2 超聲時間的確定

選取超聲時間5、15、25、35、45 min和60 min為試驗對象，按照1.3.2處理，研究不同超聲時間對富馬酸二甲酯回收率的影響。如圖8所示，試驗結果顯示超聲5～15 min，隨超聲時間的增加富馬酸二甲酯的回收率上升，15～35 min回收率較為平穩。35～60 min開始下降。選取15 min為本次試驗的超聲時間。

2.5.3 離心機轉速的確定

選取1 000、3 000、5 000、7 000、9 000 r·min-1和10 000 r·min-1離心轉速進行試驗，按照1.3.2處理，研究不同轉速對富馬酸二甲酯回收率的影響。由圖9試驗結果顯示，1 000～5 000 r·min-1回收率逐步增大，5 000～9 000 r·min-1回收率逐步降低，9 000～10 000 r·min-1回收率又逐步升高。5 000 r·min-1回收率最大。選擇5 000 r·min-1作為本次實驗的離心機轉速。

2.5.4 pH值的確定

試驗選取pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0為試驗對象，按照1.3.2處理，考察不同pH值對富馬酸二甲酯回收率的影響。如圖10所示，pH值為6.0時回收率最高，選擇pH值為6.0。

2.6 穩定性試驗

由表1知，12 d內的RSD值為1.87%，可以在0～4 ℃避光冷藏保存12 d。

2.7 精密度試驗

在已確定的色譜條件下，準確吸取富馬酸二甲酯標準溶液100 μg·mL-1共6份，每份吸取0.5 mL標準溶液，測定結果見表2。RSD平均值為0.053%，小于2%，表明精度良好。

2.8 檢出限及定量限試驗

吸取富馬酸二甲酯標準溶液100（μg·mL-1）測定，在儀器的響應值是儀器噪聲的3倍時，計算最小檢出限，儀器的響應值是儀器噪聲的10倍時，計算定量限。

2.9 加標回收率試驗

準確稱取6份6#平吉堡酸牛奶樣品，加入100 μg·mL-1富馬酸二甲酯標準液2.00、2.50、3.00 mL各2份，按照1.3.2方法處理。計算加標回收率。由表4所示，加標平均回收率為102.05%，RSD為0.25%。

2.10 樣品測定

對市場上銷售的乳制品按照所建立方法進行測定，均未檢測出富馬酸二甲酯，實驗結果如表5所示。

1～9號乳制品中富馬酸二甲酯的添加量符合國家相關限度標準的規定，合格率為100%。

3 結論

本文通過單因素試驗對乳制品前處理方法進行優化，與標準前處理方法相比具有更高的加標回收率;采用HPLC法測定乳制品中富馬酸二甲酯的含量，該方法線性關系良好，檢出限、定量限低，平均回收率高。可用于乳制品中大批量富馬酸二甲酯的測定。

參考文獻：

[1]官詠儀，邱志超，金 夢，等.高效液相色譜法同時測定食品中納他霉素和富馬酸二甲酯的含量[J].食品安全質量檢測學報，2017，8（6）：2246-2250.

[2]龐艷蘋，趙志磊，吳廣臣，等.高效液相色譜法測定面制品中富馬酸二甲酯的含量[J].食品工業科技，2009，30（9）：311，352.

[3]鄒 潔，張 征，顏春榮，等.GPC-GC-MS測定糕點和麻辣食品中的富馬酸二甲酯[J].食品科學，2011，32（24）：267-269.

[4]全國食品安全整頓辦公室.食品中可能違法添加的非食用物質名單（第二批[EB/OL].（2009-02-04）[2019-12-01].http：//law.foodmate.net/show-180881.html.