動物源性食品中10種氨基糖苷類藥物殘留量的測定

郭亞娟　付曉燕　王武強　白娜　陳江

摘 要：本文建立了一套超高效液相色譜-串聯質譜法檢測動物源性食品中10種氨基糖苷類藥物殘留的方法。通過比較不同提取試劑和提取方式下目標物的回收率，優化前處理方式。采用Agela Technologies HILIC色譜柱（2.1×100 mm，3 μm），以0.1%甲酸甲酸銨溶液和0.1%甲酸乙腈為流動相，在ESI+模式下采用選擇離子監測方式（SRM），基質標準外標法定量。結果表明，在50～4 000 mg·L-1范圍內10種氨基糖苷類藥物線性良好（R2>0.999 0），3種不同濃度的加標在動物肌肉、內臟中的回收率為71.5%～102%，RSD為3.8%～13.2%，在動物副產物中的回收率為65.5%～100%，RSD為2.0%～14.2%。該方法準確可靠，通用性強，可用于多種動物源性食品中10種氨基糖苷類藥物殘留的檢測。

關鍵詞：動物原性食品;氨基糖苷類藥物;高效液相色譜-串聯質譜

Abstract：A method was developed for the determination of aminoglycosides residues in foods of animal-derived foods by Ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. By comparing the recovery of the target substance under different extraction reagents and methods， the pretreatment method was optimized. Used the Agela Technologies HILIC column （2.1×100 mm， 3 μm）， 0.1% ammonium formate solution and 0.1% acetonitrile solution were used as mobile phase， and selected ion monitoring （SIM） was used in ESI+ mode. The results showed that the linearity of ten aminoglycosides was good in the range of 50～4 000 mg·L-1 （R2>0.999 0）. The recoveries of three different concentrations of aminoglycosides in animal muscle and viscera were 71.5%～102%， the RSD ranged 3.8%～13.2%， the recovery of animal by-products ranged 65.5%～100% ， and the RSD ranged 2.0%～14.2%. The method is accurate， reliable and versatile， and can be used for the determination of 10 aminoglycosides residues in various animal-derived foods.

Key words：Animal food; Aminoglycosides; High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

中圖分類號：R155.5

氨基糖苷類藥物是一種廣譜類抗生素，主要用于治療細菌感染，尤其是革蘭氏陰性菌引起的感染。由于該類抗生素結構穩定、不易降解，在動物組織中容易殘留，給人類帶來巨大的危害[1-2]。所以，建立一套完善、覆蓋面廣又便于使用的檢測方法具有重要的現實意義。

目前報道的氨基糖苷類藥物檢測方法有HPLC-UV[3-4]、LC-MS[5-6]和HPLC-ELSD法[7]檢測。但大多采用了離子對試劑且基質單一[7-9]。本文采用2%乙腈溶液作為提取溶液，用特定濃度的甲酸銨溶液代替七氟丁酸，在提供了電離所需的離子外，增強了目標物的保留，達到有效分離和檢測的目的。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

（1）儀器。AB SCIEX QTRAP 4500液相色譜串聯質譜儀、Mettler Toledo電子天平、VORTEX-6旋渦混合器、AS30600BT超聲水浴搖床、3K15高速冷凍離心機、TTL-DCⅡ氮吹濃縮儀。

（2）試劑。乙腈、甲酸為HPLC級，其他試劑均為分析純。

（3）標準品。10種氨基糖苷類藥物標準品：慶大霉素（GEN）、鏈霉素（STR）、雙氫鏈霉素（DISTR）、卡那霉素（KAN）、潮霉素B（HYG）、壯觀霉素（SPE）、安普霉素（AMI）、妥布霉素（TOB）、新霉素（NEO）、巴龍霉素（PAR），所有標品均來自德國Dr.ehrenstorfer公司。

（4）標準儲備液。分別準確稱取10種氨基糖苷類藥物標準品各10 mg（根據標品純度折算）于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，配制成1 mg·mL-1的標準儲備液，-18℃待用。

（5）標準工作液。選取豬肉、雞肝、魚肉、雞蛋、牛奶、蜂蜜等具有代表性的空白基質配制標準 工作液，其中SPE、DISTR、STR、KAN、TOB、GEN、PAR的工作液濃度為50、100、200、500 ng·mL-1和1 000 ng·mL-1;

HYG、APR、NEO的工作液濃度為200、500、1 000、2 000 ng·mL-1和4 000 ng·mL-1。

（6）磷酸緩沖溶液。準確稱取磷酸二氫鉀1.36 g，用980 mL水溶解，用1.0 mol·L-1鹽酸調pH到4.0，分別加入Na2EDTA 0.15 g和三氯乙酸20 g，溶解混勻并定容至1 000 mL（4℃避光保存）。

1.2 實驗條件

1.2.1 色譜條件

Agela Technologies HILIC色譜柱（2.1 mm×100 mm，3 μm）;流速：0.3 mL·min-1;進樣量：2 μL;柱溫：35 ℃;流動相A：0.1%甲酸甲酸銨溶液（含30 mmol·mL-1甲酸銨），流動相B：1%的甲酸乙腈溶液（含1 mmol·mL-1甲酸銨）;梯度洗脫程序：0～1 min，10%流動相A+90%流動相B;1～5 min，流動相A 10%～97%;5～7 min，97%流動相A保持2 min;7.1～8 min，流動相A 97%～10%;8.1～12 min，10%流動相A保持。

1.2.2 質譜條件

電噴霧電離離子源（ESI）;SRM模式：正離子掃描;噴霧電壓：5.5 kV;毛細管溫度：550 ℃;霧化氣壓力（GS1）：50 psi;輔助氣壓力（GS2）：50 psi;氣簾氣壓力（CUR）：25 psi;碰撞氣壓力（CAD）：8 psi。

1.3 樣品前處理

（1）動物肌肉、動物內臟。準確稱取2 g（精確至0.01 g）于50 mL聚丙烯離心管中，加入10 mL 2%甲酸乙腈提取液（pH為3±0.1），超聲提取20 min，離心取上清液，重復提取2次，合并上清液。準確吸取10 mL過WCX凈化樣品，用3 mL 5%的氨水溶液、3 mL 100%甲醇依次淋洗，3 mL 5%甲酸甲醇，收集洗脫液，40 ℃氮吹至盡干，1 mL流動相A定容，過0.22 μm微孔濾膜，供液相色譜-串聯質譜檢測。

（2）水產品、牛奶、雞蛋。準確稱取5 g（精確至0.01 g）于50 mL聚丙烯離心管中，加亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液各1 mL，沉淀蛋白，提取方式同動物肌肉。

2 結果與分析

2.1 提取液的選擇

氨基糖苷類抗生素結構中含有多個氨基和羥基，故呈堿性，極性和水溶性較高，所以在選取提取液時，分別比較了磷酸緩沖液、0.1%甲酸乙腈、2%甲酸乙腈（pH為3.0±0.1）等酸化提取液。結果如圖1所示，0.1%甲酸乙腈的提取效果最差，磷酸緩沖液和2%甲酸乙腈提取液（pH為3.0±0.1）效果相當，但是基于乙腈有沉淀蛋白的效果，最終選擇使用2%甲酸乙腈（pH為3.0±0.1）作為提取溶液。

2.2 凈化方式的優化

分別比較了Waters Oasis HLB（60 mg，3 mL）、Waters Oasis WCX（60 mg，3 mL）、Waters Oasis MCX

（60 mg，3 mL）3種不同類型凈化小柱的回收率，結果如圖2所示。結果表明，氨基糖苷類化合物在HLB上基本無保留，在MCX上很難洗脫下來，而在WCX有很好的保留，同時也能達到較好的凈化效果。之后我們又根據回收率優化了洗脫液和淋洗液，最終選擇5%氨水溶液作為淋洗液，5%甲酸甲醇溶液作為洗脫液。

2.3 色譜條件的優化

本文考察了C18和HILIC兩種不同色譜柱對10種氨基糖苷類藥物殘留的分離效果。結果表明，氨基糖胺類化合物在C18色譜柱上不易保留，出峰時間太早，容易引起基質干擾;而在HILIC色譜柱上得到了較好的保留，出峰時間明顯推后，且峰型尖銳，見圖3。故選用HILIC色譜柱。

分別比較了水-乙腈、甲酸水-乙腈以及甲酸甲酸銨-乙腈不同流動相對氨基糖苷類藥物響應及峰型的影響，發現在流動相中加入甲酸后，目標化合物的電離效果明顯提高，而加入甲酸銨緩沖液后，有利于穩定電離所需的酸性環境，所以最終確定選用以0.1%甲酸甲酸銨溶液和0.1%甲酸乙腈溶液為流動相。

2.4 質譜條件的優化

通過優化每個化合物的錐孔電壓、碰撞電壓等質譜參數，選擇響應最高的離子作為定量離子，次之作為定性離子，見表1。

2.5 方法的線性范圍、檢出限、回收率以及精密度

由于此類化合物基質抑制效果明顯，本方法采用基質配標，外標法定量的方法，對10種氨基糖苷類藥物進行測定，以待測物的濃度作為橫坐標，待測物的峰面積作為縱坐標，繪制標準曲線。結果顯示，壯觀霉素、雙氫鏈霉素、鏈霉素、巴龍霉素、卡那霉素、妥布霉素、慶大霉素在50～1 000 mg·L-1范圍內線性關系良好，新霉素、潮霉素B、安普霉素在200～

4 000 mg·L-1范圍內呈良好線性，選擇基質抑制最強的空白基質，添加不同濃度的質量濃度，以其3倍信噪比

（S/N）確定其中壯觀霉素、雙氫鏈霉素、鏈霉素、巴龍霉素、卡那霉素、妥布霉素、慶大霉素的檢出限LOD為20 μg·kg-1;新霉素、潮霉素B、安普霉素的檢出限LOD為100 μg·kg-1，見表2。

選取空白基質樣品，通過添加低、中、高3種不同濃度質量濃度（LOQs、2×LOQs、3×LOQs），按優化的實驗條件進行檢測，每個添加水平做6個平行。結果表明，10種氨基糖苷類藥物的回收率在65.5%～102%，相對標準偏差（RSD）在2.0%～14.2%。滿足檢測要求。

3 結論

本文采用2%甲酸乙腈作為提取溶劑，用WCX凈化柱進行凈化處理，通過優化流動相中甲酸、甲酸銨以及乙腈的配比，成功建立了一套不使用七氟丁酸離子對試劑，也能高效檢測氨基糖苷類藥物殘留的方法。本文同時考察了雞蛋、牛奶、蜂蜜、動物肌肉、內臟等可能檢出氨基糖苷類藥物殘留的所有動物源性食品，基質覆蓋面廣，是一套準確、高效、通用性強的檢測方法。

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