溫腎化痰方對(duì)ApoE基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型總膽固醇、三酰甘油及低密度脂蛋白膽固醇的影響

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是心血管疾病發(fā)生發(fā)展的基本病理基礎(chǔ)，指在大中動(dòng)脈內(nèi)膜上積聚斑塊的慢性炎癥性疾病[1]，其斑塊穩(wěn)定性決定AS的進(jìn)展及預(yù)后。有研究證明，AS易損斑塊引起斑塊破裂、血栓形成是引起急性心腦血管事件發(fā)生的主要因素[2]。易損斑塊形成與脂質(zhì)代謝障礙密切相關(guān)[3]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為易損斑塊的發(fā)生機(jī)制與虛、痰、瘀、毒有關(guān)[4]。廣東省名老中醫(yī)羅陸一教授創(chuàng)立的溫腎化痰方具有溫腎化痰、活血化瘀功效，臨床治療心絞痛等心血管疾病效果顯著[5]。本研究通過建立ApoE基因敲除小鼠AS模型，應(yīng)用不同劑量溫腎化痰方，觀察小鼠血脂變化情況，初步探討溫腎化痰方干預(yù)AS易損斑塊的效果及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇SPF(specific pathogen free)級(jí)、體重為20～30 g、6周齡ApoE-/-雄性小鼠120只，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)前普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。

1.2 藥物與飼料 溫腎化痰方(仙茅10 g，淫羊藿10 g，石菖蒲15 g，瓜蔞皮15 g，乳香15 g)加工制成含生藥0.526 5 g/mL中藥濃縮液，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房提供。高脂、高總膽固醇飼料含5%豬油及1%總膽固醇。陽性對(duì)照藥為阿托伐他汀鈣片(輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：每片20 mg)。

1.3 主要試劑與設(shè)備 測(cè)量脂質(zhì)試劑盒：血漿總膽固醇(TC，南京建成A111-1)、三酰甘油(TG，Cloud-Clone Corp：CEB687Ge)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C，CUSABIO：CSB-EQ027860MO)。低速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭飛鴿牌80-2B。

1.4 模型制備與分組 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按體重分層隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、陽性對(duì)照組、低劑量中藥組、中劑量中藥組和高劑量中藥組，各20只。空白對(duì)照組給予普通飼料喂養(yǎng)12周，余5組均予高脂、高總膽固醇飼料喂養(yǎng)8周后繼而予以高脂飼料喂養(yǎng)4周。空白對(duì)照組及模型組均不給藥，以生理鹽水1 mL/d灌胃，陽性對(duì)照組予以阿托伐他汀5 mg/(kg·d)，低劑量中藥組予以溫腎化痰方5.256 g/(kg·d)，中劑量中藥組予以溫腎化痰方10.053 g/(kg·d)，高劑量中藥組予以溫腎化痰方20.106 g/(kg·d)，以上藥液均在8周后開始灌胃，給藥4周。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.5.1 體重測(cè)量 每周測(cè)量小鼠體重并記錄，監(jiān)測(cè)小鼠體重變化。

1.5.2 血脂檢測(cè) 于第8周及第12周ApoE-/-小鼠經(jīng)尾靜脈采血后，常溫下以3 000 r/min離心5 min，吸取上層血漿，按照相應(yīng)檢測(cè)試劑盒說明書檢測(cè)血清TC、TG、LDL-C水平并記錄。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠體重比較 與空白對(duì)照組比較，第8周各組小鼠體重明顯上升(P<0.01)；與模型組比較，陽性對(duì)照組及各劑量中藥組小鼠體重變化較一致，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第12周，與空白對(duì)照組比較，余5組小鼠體重均上升(P<0.01)；與模型組比較，陽性對(duì)照組及中、高劑量中藥組小鼠體重降低(P<0.01)，低劑量中藥組體重有下降趨勢(shì)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與陽性對(duì)照組比較，低劑量中藥組體重下降幅度較小(P<0.05)，中劑量中藥組及高劑量中藥組體重下降幅度一致(P>0.05)。陽性對(duì)照組及各劑量中藥組體重與空白對(duì)照組差異較大，說明他汀類藥物及溫腎化痰方無法使高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠體重下降，但可在一定程度上控制小鼠體重上升，使體重上升幅度(體重連線斜率)接近正常小鼠。詳見表1。

表1 各組小鼠體重比較(±s) 單位：g

與空白對(duì)照組比較，①P<0.01；與模型組比較，②P<0.01；與陽性對(duì)照組比較，③P<0.01。

2.2 各組小鼠血脂指標(biāo)水平比較 第8周，與空白對(duì)照組比較，其他各組小鼠血清TC、TG、LDL-C水平均明顯上升(P<0.01)；模型組、陽性對(duì)照組及各劑量中藥組小鼠血脂水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第12周，與空白對(duì)照組比較，模型組血清TC、TG、LDL-C水平明顯上升(P<0.01)；與模型組比較，陽性對(duì)照組及各劑量中藥組小鼠血清TC、TG、LDL-C均明顯下降(P<0.01)，其中陽性對(duì)照組及高劑量中藥組血脂下降幅度明顯，接近空白對(duì)照組血脂水平；各劑量中藥組TC、TG、LDL-C水平均有不同程度下調(diào)，作用由小到大依次排列為：低劑量中藥組<中劑量中藥組<高劑量中藥組；其中高劑量中藥組血脂TC水平與陽性對(duì)照組基本一致，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，TG及LDL-C水平稍高于陽性對(duì)照組(P<0.05)。詳見表2、表3。

表2 各組第8周小鼠血脂指標(biāo)水平比較(±s) 單位：μg/mL

與空白對(duì)照組比較，①P<0.01。

表3 各組第12周小鼠血脂指標(biāo)水平(±s) 單位：μg/mL

與空白對(duì)照組比較，①P<0.01；與模型組比較，②P<0.01；與陽性對(duì)照組比較，③P<0.05。

3 討 論

AS是脂質(zhì)等物質(zhì)沉積導(dǎo)致動(dòng)脈壁硬化、管腔變細(xì)、血管失去彈性的慢性退化性改變[6]，該變化可長(zhǎng)期存在于人體體內(nèi)而無任何不適。人體固有性免疫和獲得性免疫被激活觸發(fā)全身炎性反應(yīng)，脂質(zhì)侵蝕斑塊纖維帽、血液突然轉(zhuǎn)變剪應(yīng)力等各種因素綜合作用下，斑塊穩(wěn)定性降低，從而發(fā)生斑塊破裂、血栓形成等病理變化，導(dǎo)致心肌梗死、腦梗死等嚴(yán)重心腦血管意外發(fā)生[7-9]。在眾多因素中，脂質(zhì)代謝障礙是AS形成、發(fā)展及惡化的關(guān)鍵因素之一。LDL-C等脂質(zhì)通過被破壞的血管屏障沉積于內(nèi)膜，經(jīng)過一系列氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，因吞噬凋亡形成泡沫細(xì)胞促進(jìn)AS發(fā)展，并發(fā)生組織溶解，導(dǎo)致纖維帽破裂[10]；TC等物質(zhì)通過新生血管進(jìn)入斑塊壞死核心，形成結(jié)晶并誘發(fā)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)脂質(zhì)核心形成，侵蝕纖維帽，破壞斑塊穩(wěn)定性[8]。血漿LDL-C、TG和TC等脂質(zhì)增加導(dǎo)致致敏性中性粒細(xì)胞及超氧化物增多，促進(jìn)氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，從而進(jìn)一步促進(jìn)AS易損斑塊形成[11]。

有研究表明，降低血漿脂質(zhì)水平可延緩甚至逆轉(zhuǎn)AS斑塊形成，防止斑塊破裂及血栓形成，從而降低心腦血管意外發(fā)生率。阿托伐他汀是目前經(jīng)循證醫(yī)學(xué)證實(shí)有效的抗AS的3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶選擇性抑制劑，能降低血脂含量并穩(wěn)定AS斑塊[12]。故本課題以他汀類藥物為陽性對(duì)照組，與中藥降脂作用進(jìn)行比較。

中醫(yī)學(xué)多以癥狀命名，AS起病前無癥狀，斑塊破裂后導(dǎo)致的病癥涵蓋中風(fēng)、胸痹、厥心痛、真心痛等范疇。冠狀動(dòng)脈粥樣硬化心臟病屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹、心痛”等范疇。心痛之病，病位在心，其中與腎臟功能失調(diào)關(guān)系密切。心與腎關(guān)系在《黃帝內(nèi)經(jīng)》已闡述：“心之合脈也，其榮色也，其主腎也。”心腎相互交通，陰陽協(xié)調(diào)，人體才能陰平陽秘[13]。人體年老腎陽虛衰，水液氣化失職，聚濕為痰，痰阻心胸；且衰微之腎陽無力溫煦心陽，心氣無力推動(dòng)血液運(yùn)行，血液瘀阻于心脈，故而引發(fā)本病[14]。治療本病之法當(dāng)以溫腎為本，輔以化痰散瘀之法。本課題組所用溫腎化痰方由廣東省著名中醫(yī)羅陸一教授結(jié)合自己的科研成果和二仙湯化裁而來。方中含有仙茅、淫羊藿、石菖蒲、瓜蔞皮、乳香五味藥。仙茅溫陽補(bǔ)腎、強(qiáng)骨通脈，淫羊藿補(bǔ)精益氣、堅(jiān)骨強(qiáng)心，二者同為君藥，加石菖蒲開通心竅、宣氣除痰，瓜蔞皮寬胸理氣、開痰散結(jié)，佐以乳香通瘀活血，引諸藥入心經(jīng)，全方共奏溫腎助陽，活血化瘀之效。

本研究結(jié)果顯示：在高脂、高總膽固醇飼料喂養(yǎng)8周后，小鼠體重及血漿TG、TC、LDL-C水平較空白對(duì)照組明顯上升；第12周，服用他汀類藥物及中藥小鼠體重上升幅度減慢，其中中藥組隨劑量增加小鼠體重上升幅度越慢，與陽性對(duì)照組相似，說明溫腎化痰方具有一定程度的控制體重作用；各劑量中藥組血清TC、TG、LDL-C水平較模型組明顯下降，說明溫腎化痰方下調(diào)血脂作用與阿托伐他汀相似。各劑量中藥組均有不同程度的下調(diào)血脂能力，其中高劑量中藥組血清TC水平與陽性對(duì)照組血脂基本一致，TG及LDL-C水平接近陽性對(duì)照組水平，說明高劑量溫腎化痰方下調(diào)血脂能力與阿托伐他汀一致，且均接近正常小鼠血脂水平，其中以下調(diào)TC能力最強(qiáng)。

綜上所述，溫腎化痰方具有下調(diào)AS模型小鼠血脂作用，通過調(diào)節(jié)血脂代謝紊亂，從而穩(wěn)定斑塊，防治AS，減少心腦血管意外發(fā)生，其具體作用機(jī)制及實(shí)驗(yàn)研究有待進(jìn)一步探討。