BAPN聯合Ang-Ⅱ腹腔注射建立小鼠主動脈夾層模型

主動脈夾層(aortic dissection)是最常見、最兇險的急性主動脈綜合征[1-2]，起病急驟，可在短期內引起主動脈破裂而致死，其發病率為每年6/10萬人，平均發病年齡為63歲，男性較女性更易患病，且逐年呈上升趨勢，21%病人入院前死亡，68.2%病人入院48 h內死亡，1周內病死率高達90%[3]。主動脈夾層常見的病理特征包括白細胞浸潤和結構性細胞外基質(ECM)重塑[4-5]，血管炎癥是常見的致病因素[6-7]。在主動脈重塑擴張過程中，中膜完整性被破壞是導致急性主動脈夾層或破裂高發病率和死亡率的重要原因。目前迫切需要對主動脈夾層發病機制和干預策略進行研究，然而由于主動脈夾層發生發展過程的不同時期機體組織標本難以獲得，因此，建立模擬主動脈夾層發生病理變化及可靠的、重復性好的動物模型尤為關鍵。

血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang-Ⅱ)是腎素-血管緊張素-醛固酮系統的主要效應肽，短時間內引起血管收縮、提高血壓、增加血流對血管壁沖擊[8]；誘導血管平滑肌細胞(VSMC)過度肥大、細胞外基質過度分泌，導致炎性細胞浸潤，破壞血管，誘導主動脈夾層形成[9]。Tieu等[10]報道，選用7～30周齡的雄性C57BL/6小鼠，微泵灌注Ang-Ⅱ，其主動脈夾層發生率分別為23%和25%。β-氨基丙腈(β-aminopropionitrile，BAPN)通過抑制膠原纖維交聯誘導主動脈夾層，使用含0.25%BAPN飼料飼養小鼠，建立主動脈夾層模型，發生率為64.7%[11]。C57BL/6小鼠為心血管疾病發病機制研究的常用實驗小鼠，因此，本研究采用給予C57BL/6小鼠Ang-Ⅱ及BAPN聯合腹腔注射建立主動脈夾層模型，探索一種模擬主動脈夾層發生病理變化及可靠的、重復性好的主動脈夾層動物模型新方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級雄性C57BL/6小鼠40只(山西醫科大學實驗動物中心提供)，動物合格證編號SXYK(晉)2015-0001，體重(19.50±0.42)g，鼠齡6～8周。將小鼠隨機分為4組：BAPN組[BAPN 0.1 g/(kg·d)]、Ang-Ⅱ組[Ang-Ⅱ12 mg/(kg·d)]、BAPN+Ang-Ⅱ組[BAPN 0.1 g/(kg·d)+Ang-Ⅱ 12 mg/(kg·d)]和對照組(生理鹽水)，均采用腹腔注射。建立主動脈夾層小鼠模型，每日按實驗方法對不同組別小鼠給予相應處理，時間為2周，每8 h觀察1次小鼠，每2 d記錄1次體重，直至實驗結束。若發現有小鼠死亡，隨即取出解剖，探查死亡原因。

1.2 主要試劑、材料與儀器 Ang-Ⅱ購自美國Sigma公司，BAPN購自美國Alfa Aesar公司；蘇木素、伊紅購自北京中杉金橋生物技術有限公司；多聚甲醛、無水乙醇、二甲苯購自上海生工生物工程有限公司；ASP6025型脫水機，德國Leica生產；5235型石蠟包埋機，日本Sakura生產；RM2016，德國Leica生產；CP225D電子分析天平，德國Sartorius公司生產；Scope A1型顯微成像系統，德國ZISS公司生產。

1.3 實驗方法

1.3.1 藥物配制 將BAPN粉末溶于無菌生理鹽水中，小鼠BAPN劑量為每日0.1 g/kg。每兩天配制1次新溶液，以錫箔紙包裹(BAPN見光易分解)。Ang-Ⅱ粉末溶于無菌生理鹽水中，小鼠Ang-Ⅱ劑量為每次4.0 mg/kg，每日3次，間隔8 h。

1.3.2 小鼠一般情況及血管形態觀察 每日觀察小鼠精神狀態和進食情況；每2 d稱重1次。發現死亡小鼠，立即解剖，觀察死亡原因，摘取主動脈，用4%多聚甲醛固定。待實驗結束時，對仍未死亡小鼠，給予過量戊巴比妥鈉處死，顯微鏡下分離主動脈，從主動脈根部剝離動脈至髂動脈分支處，小心去除動脈外膜的疏松結締組織，觀察夾層形成情況。計算小鼠主動脈夾層發生率和死亡率。

1.3.3 病理切片制備 以4%多聚甲醛灌流固定主動脈組織，再常規浸泡于此固定液中72 h，石蠟包埋，切成5 μm厚度切片。烤片后，脫蠟、水化，蘇木素染色5 min，鹽酸酒精分化數秒，氨水浸泡15 min，伊紅染色2 min，蒸餾水沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。

2 結 果

2.1 小鼠一般情況 小鼠體重隨日齡增加而增加，4組體重無明顯差異(見圖1)。第14天時，BAPN+Ang-Ⅱ組較對照組體重增加較少。對照組一般情況良好，各實驗組經BAPN和Ang-Ⅱ腹腔注射后，毛發無光澤，活動較對照組不靈活，雙下肢跛行(是臨近死亡表現)。

圖1 小鼠體重變化曲線

2.2 4組主動脈夾層形成情況比較 實驗過程中，對照組無主動脈夾層形成；BAPN組主動脈夾層形成率為20.0%；Ang-Ⅱ組主動脈夾層形成率為70.0%，破裂率為20.0%，其中1只死于腹腔注射第3天，1只死于第10天，死亡原因為主動脈夾層破裂；BAPN+Ang-Ⅱ組主動脈夾層形成率為80.0%，破裂率為10.0%，1只死于腹腔注射第12天，死亡原因為主動脈夾層破裂。詳見表2，圖2、圖3。

表2 4組主動脈夾層形成情況比較 單位：只(%)

圖2 各組小鼠死亡率比較

圖3 各組主動脈夾層發生率

2.3 各組小鼠主動脈病理觀察 對照組未發現肉眼可見的主動脈夾層形成，血管壁結構完整，平滑肌細胞排列整齊；各實驗組主動脈可見明顯擴張及壁內血腫；BAPN+Ang-Ⅱ組假腔中血細胞充盈，血管壁增厚及血管外膜炎癥細胞浸潤較BAPN組和Ang-Ⅱ組明顯，Ang-Ⅱ組次之，BAPN組最輕。詳見圖4。

圖4 4組小鼠主動脈病理觀察

3 討 論

主動脈夾層是血液經過主動脈內膜撕裂處進入中膜，中膜被撕裂，進而形成真假兩腔的一類疾病[12-13]，組織病理學明顯特征是中膜的退行性變化、平滑肌細胞凋亡、彈性纖維破碎和消失，炎性細胞浸潤是具體表現形式[14]。

目前主動脈夾層動物模型構建方法主要包括以下幾種。①外科誘導法：選用大型動物作為研究對象，如豬、犬等，手術直接造成主動脈形態學改變，形成與人體主動脈夾層形態相似的動物模型[15]，但直接手術誘導不能模擬主動脈夾層發生發展過程，與臨床主動脈夾層組織病理學上存在一定差距，發病機制存在一定局限性[16]。②轉基因技術誘導法：Ⅰ型(Callal)和Ⅲ型(Col3a1)膠原蛋白基因剔除大鼠，雙糖鏈蛋白多糖(BGN)基因剔除大鼠[17]，可建立主動脈夾層模型，但由于自身基因異常，在人類主動脈夾層研究仍存在局限性。③藥物誘導：BAPN通過抑制膠原纖維交聯誘導主動脈夾層。

本研究結果證實，使用BAPN、Ang-Ⅱ和BAPN聯合Ang-Ⅱ腹腔注射可成功構建小鼠主動脈夾層模型，肉眼可見實驗組主動脈明顯擴張和壁內血腫形成，蘇木素-伊紅(HE)染色后鏡下可見血管壁撕裂，大量血細胞進入管壁，彈力纖維紊亂、斷裂，炎性細胞浸潤，證明造模成功。實驗室前期研究發現給予C57BL/6小鼠BAPN 0.667 g/(kg·d)可導致小鼠死亡，死亡率100.0%，當BAPN劑量減少至0.333g/(kg·d)時，小鼠死亡率下降，動脈破裂率仍達到40.0%。參考既往實驗結果，認為選擇100 mg/(kg·d)和4 mg/(kg·d)(每隔8 h給藥1次)，觀察小鼠主動脈夾層不同形成效果。因此，選擇3種BAPN和Ang-Ⅱ方案。其中，BAPN組采用BAPN，主動脈夾層形成率為20.0%，其余80.0%動脈病理顯示炎癥反應，但未形成主動脈夾層。Ang-Ⅱ組采用Ang-Ⅱ，主動脈夾層形成率為70.0%，破裂率為20.0%，可能血壓升高導致血管破裂。前期實驗顯示，BAPN濃度上升至0.333 g/(kg·d)，聯合Ang-Ⅱ，死亡率高達80.0%(結果未顯示)，可能是由于BAPN處理后導致膠原蛋白和彈性蛋白交聯障礙，此時給予Ang-Ⅱ，血管壁壓力過大引起破裂，導致死亡。BAPN降至100 mg/(kg·d)，BAPN+Ang-Ⅱ組主動脈夾層形成率為80.0%，破裂率僅為10.0%。

綜上所述，推薦使用6～8周齡C57BL/6雄性小鼠，BAPN 100 mg/(kg·d)和Ang-Ⅱ4 mg/(kg·d)(每隔8 h給藥一次)腹腔注射飼養2周，可形成主動脈夾層。腹腔注射較文獻報道飼料喂養、給水灌胃在劑量方面更易控制；較微量泵而言，雖然不能模擬持續給藥過程，但每隔8 h給藥一次，操作更簡單，造模費用更低，無須特殊儀器。本研究建立符合疾病病理變化，是可靠的、重復性好的主動脈夾層小鼠模型，為探討主動脈夾層發病機制及相應治療提供了研究基礎。