急性缺血性腦卒中病人血清miR-7和miR-200b表達水平及與腦側支循環分級的關系探討

急性缺血性腦卒中(cerebral ischemic stroke，CIS)是指因腦部血液供應突然發生中斷引起腦組織軟化或壞死的一種急性疾病[1]。流行病學研究表明，我國居民患腦卒中比例為1 114.8/10萬人，年發病率為246.8/10萬人，死亡率高達46%，給我國人民的生命安全造成巨大威脅[2]。有研究表明，超早期血管再通術通過構建腦側支循環實現對CIS的有效治療，腦側支循環的形成對早期血管介入治療和病人預后具有一定指導價值[3]。因此，尋找有效預測CIS病人腦側支循環形成的標志物十分必要。隨著分子生物學相關技術進步和研究的開展，血清微小RNA(microRNA，miRNA)等作為標志物應用于疾病的診斷價值日漸受到關注[4]。張家康等[5]報道，腦側支循環的建立與血管生成密切相關，涉及多種miRNAs參與。本研究通過檢測CIS病人血清miR-7、miR-200b水平，旨在分析miR-7、miR-200b與CIS病人側支循環分級的關系，探討血清miR-7、miR-200b水平對CIS病人三級側支循環的預測價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2016年5月—2018年5月在我院神經內科住院治療的126例CIS病人為研究對象，根據腦側支循環的建立情況分為一級側支循環組、二級側支循環組和三級側支循環組。一級側支循環組44例，男24例，女20例，年齡27～78(61.25±11.74)歲；二級側支循環組63例，男35例，女28例，年齡30～79(59.43±10.25)歲；三級側支循環組19例，男12例，女7例，年齡25～76(58.91±10.68)歲。按照數字減影血管造影(DSA)結果對所有受試者的腦側支循環進行評估，采用美國介入和治療神經放射學會/介入放射學會(ASITN/SIR)血流分級系統對所有受試者側支循環的血流代償程度進行評價[6]。納入同期來我院體檢的健康體檢者50名為健康對照組，男28名，女22名，年齡26～77(59.17±10.76)歲。各組研究者一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)。本研究經南陽市中心醫院倫理委員會批準。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準 符合2014年急性缺血性腦卒中診治指南[7]；均經顱腦MRI或CT檢查證實；梗死病灶位于前循環；發病7 d內，住院并經DSA檢查確認建立腦側支循環；資料完整；病人或家屬對本研究知情，并簽署知情同意書。

1.2.2 排除標準 病灶對側大腦或頸動脈存在嚴重病變；合并冠狀動脈粥樣硬化致心臟病；合并其他惡性腫瘤；臨床資料不完整。

1.3 試劑與儀器 Trizol RNA提取試劑，日本Takara公司；AceQ qPCR SYBR?Green Mix、mirPremier?microRNA Isolation Kit、microRNA qPCR試劑盒，美國Sigma公司；熒光定量PCR儀，美國Bio-Rad公司；IN-TEGRIS C/V血管機，荷蘭Philips公司產品等。

1.4 DSA檢查評估側支循環情況 對CIS病人行數字減影主動脈及腦部全血管造影檢查，分別對雙側頸總動脈、雙側鎖骨下動脈、頸內動脈和雙側椎動脈行正、側、斜、湯氏位檢查，觀察血管情況，對CIS病人腦側支循環代償情況進行分級。一級：通過Willis環進行血流代償；二級：通過軟腦膜吻合支、眼動脈及其他較小的側支及吻合支進行血流代償；三級：通過新生血管進行血流代償。

1.5 實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測miR-7、miR-200b水平 分別于入院24 h內和體檢當日采集CIS病人和健康體檢者靜脈血5 mL置于乙二胺四乙酸(EDTA)試管中，4 ℃條件下，以3 000 r/min離心10 min，收集上層血清，提取血清總RNA，之后使用反轉錄試劑進行操作得到cDNA。以上述cDNA為模板對miR-7、miR-200b進行擴增。本研究采用反應體系：上下游引物分別 0.5 μL，SYBR?Green混合液5 μL，100 ng/μL cDNA 0.5 μL，去離子水3.5 μL，總體積10 μL。按照說明設置反應程序，采用2-△△CT法對miR-7、miR-200b表達情況進行分析。qRT-PCR引物序列見表1，相對表達水平以U6作為內參。

表1 qRT-PCR引物序列

2 結 果

2.1 CIS組與對照組血清miR-7、miR-200b表達水平比較 與對照組比較，CIS組血清miR-7、miR-200b水平均明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表2。

組別例數miR-7/U6miR-200b/U6對照組501.03±0.181.08±0.15CIS組1260.45±0.110.38±0.09t值25.99737.987P0.0000.000

2.2 血清miR-7、miR-200b水平診斷CIS的臨床價值 血清miR-7、miR-200b水平對CIS病人與對照組均具有較強的區分能力。血清miR-7水平對CIS病人診斷的ROC曲線下面積(AUC)為0.734(P<0.001)，以

miR-7/U6≤0.49診斷CIS疾病的靈敏度為63.41%，特異度為75.70%，詳見圖1A。血清miR-200b水平對CIS病人診斷的AUC為0.667(P<0.001)，以miR-200b/U6≤0.43診斷CIS疾病的靈敏度為57.89%，特異度為74.61%。詳見圖1B。

圖1 血清miR-7、miR-200b水平診斷CIS的ROC曲線

2.3 血清miR-7、miR-200b表達與CIS病人臨床指標的關系 不同腦側支循環分級和不同ASITN/SIR血流分級的CIS病人血清miR-7、miR-200b表達比較，差異有統計學意義(P<0.05)；不同性別、年齡、高血壓和高脂血癥CIS病人血清miR-7、miR-200b表達比較，差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表3。

表3 血清miR-7、miR-200b表達與CIS病人臨床指標的關系 單位：例

2.4 不同腦側支循環分級的CIS病人血清miR-7、miR-200b表達水平比較 與對照組比較，一級側支循環組、二級側支循環組和三級側支循環組CIS病人血清miR-7、miR-200b水平均明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與一級側支循環組比較，二級側支循環組和三級側支循環組CIS病人血清miR-7、miR-200b水平明顯降低(P<0.05)；與二級側支循環組比較，三級側支循環組CIS病人血清miR-7、miR-200b水平明顯降低(P<0.05)。詳見表4。

組別例數miR-7/U6miR-200b/U6對照組501.03±0.181.08±0.15一級側支循環組440.55±0.13①0.50±0.11①二級側支循環組630.42±0.09①②0.36±0.09①②三級側支循環組190.31±0.07①②0.29±0.06①②

與對照組比較，①P<0.05；與一級側支循環組比較，②P<0.05；與二級側支循環組比較，③P<0.05。

2.5 血清miR-7、miR-200b水平對建立三級側支循環系統CIS病人的預測價值 分析結果表明，血清miR-7水平對建立三級側支循環系統CIS病人預測的AUC為0.894(P<0.001)，miR-7/U6≤0.32預測建立三級側支循環系統的靈敏度為79.82%，特異度為86.91%，詳見圖2A。血清miR-200b水平對建立三級側支循環系統的CIS病人預測AUC為0.876(P<0.001)，miR-200b/U6≤0.29預測建立三級側支循環系統的靈敏度為71.90%，特異度為84.73%，詳見圖2B。

圖2 血清miR-7、miR-200b水平對三級側支循環系統建立的ROC曲線

3 討 論

CIS是一種突發性腦部疾病，其發病無明顯癥狀，發病速度較快，多發生于45～70歲中老年人[8]。缺血導致血栓形成的部位和大小與腦組織壞死程度有關，疾病發生后，多造成病人言語障礙、智力障礙、活動障礙等，嚴重者導致死亡[9]，威脅人類身體健康和生命安全。前期建立形成良好的腦側支循環可顯著改善病人梗死情況，腦側支循環是指腦部動脈供血不足時，血流通過側支血管或新生血管吻合到達缺血部位，從而使缺血部位得到代償性灌注。因此，尋找有效評估腦側支循環情況的生物分子標志物，可為CIS臨床治療方案的制定提供理論支持。

miRNA通過結合靶基因mRNA3′非編碼區發揮調節基因表達作用，在多種生理病理過程中具有重要作用[10]。有研究表明，許多miRNA與多種疾病發生有關，如CIS等疾病的發生與miRNA異常表達有關[11]。miRNA一般情況下在細胞內發揮作用，極少穿過細胞膜進入循環系統；當機體處于病理狀態時，miRNA可被分泌囊泡或直接分泌至細胞外。進入血液/血清miRNA具有穩定性強的特點，可抵抗體內RNase降解，穩定地存在于血液中且極易被檢測[12]。miRNA在不同組織細胞的表達和分布具有較大差異，與機體病理是否發生損傷及損傷類型有關[13]。基于此，血清miRNA有望成為診斷疾病的可能生物標志物，具有一定的應用推廣前景。然而，現階段有關血清miRNA與CIS病人腦側支循環建立情況的研究較少。

miR-7是一種常見的miRNA。Pollock等[14]研究發現，miR-7在大腦皮層中高表達，阻斷miR-7的表達通過上調p53等靶蛋白抑制神經祖細胞生長，促進其凋亡，導致某些腦缺陷，提示miR-7與大腦組織發育相關。Piwecka等[15]研究發現，miR-7等多種miRNA表達異常與神經精神性障礙和大腦功能異常有關。上述研究提示正常情況下miR-7在腦組織中高表達，其表達異常與腦組織相關疾病有關。Li等[16]研究表明，miR-7下調直接靶向血管內皮生長因子(VEGF)的轉錄激活因子——Kruppel樣因子4，從而促進VEGF表達，促進血管生成，提示miR-7是血管類疾病治療的潛在靶點。腦側支循環系統的建立實質是新生血管形成的過程，與腫瘤組織侵襲過程中血管生成一致。有研究表明，miR-200b可抑制惡性腫瘤組織侵襲過程中的血管形成，認為作為抑癌因子參與腫瘤的發生[17]。Sinha等[18]研究發現，在多種腫瘤組織中檢測到miR-200b表達下調，miR-200b在損傷部位表達下調，可誘導創傷性血管生成，提示miR-200b可作為開關，誘導成人血管生成，但miR-7和miR-200b與CIS病人發病關系不明確。

本研究結果顯示，CIS病人血清miR-7、miR-200b表達水平顯著低于對照組，表明血清miR-7、miR-200b表達下調可能參與CIS的發病。分析結果顯示，血清miR-7水平對CIS病人診斷的AUC是0.734，血清miR-200b水平對CIS病人診斷的AUC是0.667，表明miR-7和miR-200b可區分對照組和CIS病人，提示檢測血清miR-7和miR-200b可用于早期篩查CIS疾病，且血清miR-7具有較高的臨床應用價值。

根據CIS病人腦側支循環建立情況分為一級側支循環、二級側支循環和三級側支循環，其中三級側支循環病人已逐步形成新生血管，血流代償程度較高，發生出血轉化概率較低，病人預后更好，而一級、二級側支循環病人血流代償程度較低，治療重點在于采取手術介入等方法有效促進良好側支循環的建立[19-20]。因此，準確評估CIS病人側支循環的建立情況對分辨三級側支循環CIS病人，制定相應的治療策略，盡早干預，控制病人病情，改善預后十分重要。本研究結果顯示，三級側支循環組CIS病人血清miR-7、miR-200b水平明顯低于一級、二級側支循環組CIS病人，表明miR-7、miR-200b可能與CIS病人側支循環建立情況有關。進一步分析發現，血清miR-7、miR-200b水平對三級側支循環CIS病人和一級、二級側支循環CIS病人、對照組之間有較強的區分能力，且miR-7/U6≤0.32預測CIS病人三級側支循環的AUC為0.791，miR-200b/U6≤0.29預測CIS病人三級側支循環的AUC為0.876，靈敏度及特異度較高，提示檢測CIS病人血清miR-7、miR-200b水平對側支循環建立情況可進行初步預測，且miR-200b預測價值好。

綜上所述，CIS病人血清miR-7、miR-200b低表達，且不同分級側支循環病人存在明顯差異，一定程度可預測CIS病人的側支循環建立情況，推測血清miR-7、miR-200b水平可能用于CIS病人側支循環情況的預測，為臨床制定合理的治療策略提供參考。