免疫親和柱凈化液相色譜柱后光化學衍生法測定調味品中黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1

徐小存 胡銀燕

摘 要：目的：建立免疫親和柱凈化液相色譜柱后光化學衍生法測定調味品中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2。方法：樣品經甲醇-水（7+3）提取過濾，稀釋后，濾液經免疫親和柱凈化，采用HPLC柱后光化學衍生-熒光檢測器測定其含量。結果：黃曲霉毒素B1、G1、B2、G2檢出限分別為0.12、0.28、0.04、0.12 μg·kg-1，

其相關系數(shù)均大于0.999 5，回收率為66%～97%，RSD小于10%。結論：該方法具有操作簡單、快速、準確度高、靈敏度高等優(yōu)點，適用于調味品中黃曲霉毒素的測定。

關鍵詞：黃曲霉毒素;柱后光化學衍生;調味品;高效液相色譜;免疫親和柱

Abstract：Objective： To establish a method for the determination of aflatoxin B1， B2， G1， G2 in condiment by immune-affinity column cleaning up and HPLC with post-column photochemical derivation. Methods： Samples were extracted with methanol-water （7+3） solution， the extractions were purified by immune-affinity column after filteration and dilution， separation of aflatoxin were measured by post-column photochemical instrument. Results： the limits of detection of aflatoxin B1、G1、B2 and G2 were 0.12， 0.28， 0.04， 0.12 μg·kg-1 respectively， the correlation coefficient of all aflatoxins was greater than 0.999 5， and the recovery rates were from 66% to 97%， RSD was below 10%. Conclusion： The method is easy， quick， precise and high-sensitive， which is suitable for the determination of aflatoxins in condiments.

Key words：Aflatoxins; Post-column photochemical derivation; Condiment; HPLC; Immune-affinity column

中圖分類號：O657.7

黃曲霉毒素是一種天然毒素，它的產生與環(huán)境密切相關。調味品在日常生活中必不可少，在其加工、運輸、存儲過程中易發(fā)生霉變。為保證飲食安全，需建立黃曲霉毒素檢測方法。目前黃曲霉毒素檢測方法有薄層色譜法[1]、酶聯(lián)免疫法[2]、液相色譜法[3]等。本文采用免疫親和柱凈化-光化學柱后衍生-液相色譜熒光法檢測調味品中4種黃曲霉毒素。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料。72種調味品（花椒、辣椒）來自于江西省九江市、區(qū)、縣各超市及集貿市場，包括散裝及定型包裝;黃曲霉毒素六合一免疫親和柱（IAC-SEP）;甲醇，購自國藥集團化學試劑有限公司;玻璃纖維濾紙（直徑11 cm）;黃曲霉毒素總量標準品（美國SUPELCO，批號：LB96951）;B1、B2、G1、G2分別為1.039、0.314、1.056、0.288μg·mL-1;實驗用水經Water Purifer超純水機制備，0.45 μm濾膜過濾后使用。

儀器。島津LC-20AT高效液相色譜儀配熒光檢測器，Coloversil HPLC Column 4.6 mm×250 mm，5 μm），購自美國CLOVER;光化學衍生器（型號：PHRED美國AURA）;泵流操作架，購自北京中檢維康技術有限公司;真空泵（型號：AP-01P VACUUM PUMP，天津奧特賽恩斯儀器有限公司）;渦旋混勻器（型號：VORTEX-GENIE2，上海易擴儀器有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件

流動相：甲醇-水（45+55）在線混合;流速：1.0 mL·min-1;進樣量：50 μL;柱溫：35 ℃;檢測波長：激發(fā)波長360 nm;發(fā)射波長440 nm。

1.2.2 樣品前處理

（1）樣品提取及稀釋。準確稱取調味品粉末2.5 g

于50 mL離心管中，加入1 g氯化鈉，25 mL甲醇-水（7+3），混合均勻。定性濾紙過濾，準確移取10 mL濾液并加入20 mL純水稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾，至濾液澄清，備用。

（2）樣品凈化。將免疫親和柱連接于10 mL玻璃注射器下。準確移取20 mL樣品提取液注入玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調節(jié)壓力使溶液以2 mL·min-1流速緩慢通過免疫親和柱，直至2～3 mL空氣流過柱體。以10 mL水淋洗柱子3次，棄去全部淋出液，并使2～3 mL空氣通過柱體。準確加入1.0 mL甲醇洗脫，收集全部洗脫液于玻璃試管中，加入1.0 mL純水，混勻，待測定。

1.2.3 標準曲線

標準儲備液：用甲醇-水（1+1）將標準品稀釋10倍，至黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2濃度分別為103.9、31.4、105.6、28.8 ng·mL-1。將儲備液逐級稀釋到適宜的標準工作溶液，對標準工作液和樣液在上述色譜條件下測定，進樣量50μL，以保留時間定性，峰面積定量。

2 結果與分析

2.1 光化學柱后衍生效果

黃曲霉毒素B1、G1具有很強的熒光性，但接觸水后易發(fā)生熒光淬滅現(xiàn)象，熒光性消失液相色譜難以檢測，要用衍生的方法增強其熒光性。用光化學的方法對B1、G1進行衍生，B2、G2則不受衍生的影響，操作簡單、實驗重復性好，靈敏度高，適用于大批量樣品的檢測。

2.2 標準曲線及標準品圖譜

標準曲線見表1，標準溶液色譜圖見圖1。

2.3 方法檢出限及定量限

將0.16 ng·mL-1的黃曲霉毒素B1標準品進樣25 μL進行多次測定，其峰高均約為基線噪聲高度的3倍，因此儀器檢出限為0.08 ng·mL-1，方法檢出限為0.12 μg·kg-1，黃曲霉毒素B2、G1、G2的儀器檢出限依次為0.03、0.19、0.08 ng·ml-1，方法檢出限依次為：0.04、0.28、0.12μg·kg-1。B1、B2、G1、G2方法定量限依次為0.4、0.13、0.9、0.4 μg·kg-1。

2.4 回收率和精密度實驗

用不含黃曲霉毒素的花椒和辣椒樣品作為空白樣品進行加標回收實驗，在樣品中分別添加不同濃度的標準品后，按照樣品前處理步驟進行前處理，按照1.2.1色譜條件測定其回收率。每個加標樣品連續(xù)測定6次，結果見表2、表3。對被測組分含量小于0.1 mg·kg-1的樣品，回收率范圍應在66%～97%，花椒、辣椒回收率均符合要求，該方法精密度高，RSD<10%。

2.5 實際樣品的測定

采用本法對72種調味品進行檢測，樣品圖譜基本無干擾雜質峰，測定結果70種調味品均未檢出黃曲霉毒素，其中有2種檢出黃曲霉毒素B1，含量分別為2.7μg·kg-1、0.6 μg·kg-1，食品安全國家標準暫未對調味品花椒、辣椒中真菌毒素限量進行規(guī)定[4]。

3 結論

本方法采用免疫親和柱凈化-柱后光化學衍生-液相色譜熒光法測定了調味品中黃曲霉毒素，凈化效果好，方法簡單，適用于大批量樣品中黃曲霉毒素的檢測，同時該方法也滿足我國對黃曲霉毒素限量的檢測要求。

參考文獻：

[1]張 鵬，趙衛(wèi)東，張藝兵.高效薄層色譜法測定黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2[J].分析化學，2000（3）：392.

[2]王彩云，王政綱，云戰(zhàn)友.酶聯(lián)免疫法測定食品和飼料中的黃曲霉毒素[J].食品工程，2007（4）：58-60.

[3]Ibá?ez-Vea M，Corcuera L A，Remiro R，et al.

Validation of a UHPLC-FLD method for the simultaneous quantification of aflatoxins， ochratoxin A and zearalenone in barley[J].Food Chemistry，2011，（1271）：351-358.

[4]國家衛(wèi)生和計劃生育委員會 國家食品藥品監(jiān)督管理總局.GB 2761-2017食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量[S].北京：中國標準出版社，2017.