幽門螺桿菌感染小鼠胃內菌群、短鏈脂肪酸變化及丁酸鹽對胃癌細胞增殖遷移的影響

劉庭玉，高振軍，沈曼茹，黃繼英，唐鄂，張國新

復旦大學附屬中山醫院青浦分院，上海201799

幽門螺桿菌為革蘭陰性微需氧菌，屬于胃內微生態環境中的代表性菌，已被世界衛生組織列為Ⅰ類致癌因子，根除幽門螺桿菌可有效降低胃癌發生率[1]。幽門螺桿菌感染可競爭性抑制胃內其他菌群定植，導致胃內菌群豐度改變，從而影響菌群代謝物的產生及其含量變化[2]。丁酸屬于短鏈脂肪酸的一種，可由胃內菌群代謝生成，在調節宿主代謝、免疫系統和細胞增殖方面均具有關鍵作用。丁酸是丁酸鹽在體內的主要成分，目前關于其是否參與胃癌的發生鮮見報道。2015年8月～2017年3月，本研究觀察了幽門螺桿菌對小鼠胃內常見菌群及短鏈脂肪酸的影響，并探討丁酸鹽對胃癌細胞增殖、遷移的影響，以期為探討幽門螺桿菌促進胃癌發生的相關機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 動物：SPF級C57BL/6雌性小鼠24只，體質量18～22 g，周齡6～8周，購于南京醫科大學實驗動物中心。細胞：人胃癌細胞系AGS購于上海ATCC研究所。菌株：VacA(+)、CagA(+)的幽門螺桿菌悉尼菌株(H.pylori SS1)購于上海ATCC研究所。主要試劑：FBS、RPMI 1640購于美國Gibco公司，青/鏈霉素混合液購于上海碧云天生物技術有限公司，布氏肉湯、哥倫比亞瓊脂、丁酸鹽購于美國Sigma公司，脫纖維綿羊血購于南京羊血供應站，混合型氣體(10% CO2、5% O2、85% N2)購于南京天澤氣體有限責任公司。主要儀器：高效液相色譜儀購于美國Waters Beeze公司。

1.2 幽門螺桿菌感染小鼠胃內常見菌群及短鏈脂肪酸變化觀察

1.2.1 動物分組處理 所有小鼠適應性飼養1周，隨機分為幽門螺桿菌組及對照組，每組12只。幽門螺桿菌組灌胃前禁食24 h、禁水6 h，每只小鼠先給予2% NaHCO30.1 mL灌胃，15 min后給予濃度為3×108cfu/mL的H.pylori SS1菌液0.3 mL灌胃；隔日1次，共3次。對照組禁食24 h、禁水6 h，給予布氏肉湯0.4 mL灌胃；隔日1次，共3次。兩組灌胃后均禁食、禁水12 h，隨后恢復正常飲食飲水。兩組灌胃后6、12個月分別取6只小鼠，均予頸椎脫臼法處死，解剖取出胃組織，立即置于液氮中，隨后轉移至-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 胃內常見菌群豐度檢測 采用real-time PCR法。取兩組灌胃后12個月的胃組織，將組織用剪刀剪碎，置于勻漿器中攪拌至泥漿樣。采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA，由上海諾百生物科技有限公司完成細菌標準品的制備。按照1×102～1×109每10倍梯度，使用Biophotmeter檢測儀自動制備標準曲線；根據制成的標準曲線，計算每個待測樣本的數目。PCR反應體系10 μL：去離子水3.6 μL， SYBR Green(包括4×dNTP，MgCl2和Taq聚合酶，10×緩沖液)5 μL，上、下游引物(25 mmol/L)各0.2 μL，DNA提取模版1.0 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸45 s，共40個循環，4 ℃保存。使用溫度梯度PCR擴增儀檢測乳酸桿菌、柔嫩梭菌、擬球梭菌、普氏桿菌、擬脆弱桿菌、腸桿菌及幽門螺桿菌等菌群豐度。

1.2.3 胃組織乙酸、丙酸、丁酸水平檢測 采用高效液相色譜法。取兩組灌胃后6、12個月的胃組織各100 mg，加入1 mol/L鹽酸飽和氯化鈉溶液100 μL進行酸化。配置SCFAs標準品10 mg/mL，并依次稀釋為1、5、10、50、500 μg/mL的標準圈樣本。使用高效液相色譜儀檢測乙酸、丙酸、丁酸水平，參數設置：流速10 μL/20 min，柱溫為室溫，檢測波長210 nm。

1.3 丁酸鹽對胃癌細胞增殖、遷移的影響觀察

1.3.1 細胞增殖能力觀察 采用CCK-8法。將胃癌細胞系AGS傳代接種至6孔板，調整細胞密度為1×105～5×105/孔，隨機分為丁酸鹽組和空白對照組。丁酸鹽組分別加入終濃度為0.5、1.0、2.5 mmol/L的丁酸鹽，空白對照組未予特殊處理，作用24 h。將兩組細胞按3×103～5×103/孔接種于96孔板，每組設5個復孔。每孔加入完全培養基100 μL，于37 ℃、5% CO2培養箱中進行培養，接種孔四周加入PBS 100 μL。兩組分別于培養0、12、24、48 h向孔中加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃孵育1 h。采用酶標儀檢測450 nm波長處的光密度(OD)值，以此表示細胞增殖能力。

1.3.2 細胞侵襲能力觀察 采用Transwell侵襲實驗。將胃癌細胞系AGS傳代接種至6孔板，調整細胞密度為1×105～5×105/孔，隨機分為丁酸鹽組和空白對照組。丁酸鹽組加入終濃度為2.5 mmol/L的丁酸鹽，空白對照組未予特殊處理，作用24 h。收集兩組細胞，重懸于無血清培養液中，調整細胞密度為1×105/100 μL。于Transwell小室上室加入細胞懸液100 μL、含2% FBS的RPMI 1640培養液200 μL，下室加入含10%～20% FBS的RPMI 1640培養液600 μL，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養36 h。取出孔板，常規進行固定、染色，顯微鏡下對進入下室的細胞進行計數。

2 結果

2.1 幽門螺桿菌組與對照組胃內常見微生物菌群豐度情況 幽門螺桿菌組胃內的微生物菌群按照豐度排序依次為：幽門螺旋桿菌(0.908 5±0.119 6)lg cfu/mg，柔嫩梭菌(0.763 4±0.108 5)lg cfu/mg，擬球梭菌(0.759 7±0.102 4)lg cfu/mg，乳酸菌(0.748 2±0.094 6)lg cfu/mg，普氏菌(0.690 2±0.040 3)lg cfu/mg。對照組胃內的微生物菌群按照豐度排序依次為：擬球梭菌(0.724 2±0.175 5)lg cfu/mg，乳酸菌(0.722 6±0.115 9)lg cfu/mg，腸桿菌(0.707 5±0.093 3)lg cfu/mg，柔嫩梭菌(0.705 8±0.082 5)lg cfu/mg。

2.2 幽門螺桿菌組與對照組胃組織乙酸、丙酸、丁酸水平比較 幽門螺桿菌組灌胃后6個月胃組織丁酸水平高于對照組(P<0.05)。與灌胃后6個月比較，幽門螺桿菌組與對照組灌胃后12個月胃組織乙酸、丙酸、丁酸水平均升高，且幽門螺桿菌組升高更明顯(P均<0.05)。見表1。

表1 幽門螺桿菌組與對照組胃組織乙酸、丙酸、丁酸水平比較

注：與同組灌胃后6個月比較，*P<0.05；與對照組同時間點比較，#P<0.05。

2.3 丁酸鹽組與空白對照組細胞增殖能力比較 與對照組同時間點比較，加入不同濃度丁酸鹽的丁酸鹽組作用24、48 h的OD值均升高(P均<0.05)。相同作用時間下，丁酸鹽組OD值隨著丁酸鹽濃度的升高而升高，以2.5 mmol/L作用48 h時的OD值最高(P均<0.05)。見表2。

表2 丁酸鹽組與空白對照組細胞增殖能力比較

注：與空白對照組同時間點比較，*P<0.05；與加入0.5 mmol/L丁酸鹽的丁酸鹽組比較，#P<0.05；與加入1.0 mmol/L丁酸鹽的丁酸鹽組比較，△P<0.05。

2.4 丁酸鹽組與空白對照組細胞遷移能力比較 丁酸鹽組與空白對照組進入下室的細胞數分別為(221±32)、(85±14)個，兩組比較P<0.05。

3 討論

胃內微生態是胃腸道微生態系統中的一個獨特區域，幽門螺桿菌的存在可影響其微生物菌群組成，但組成成分的改變仍具有爭議性。既往研究顯示，幽門螺桿菌陰性個體中最豐富的菌群依次是鏈球菌、乳酸桿菌、韋榮菌、普氏菌[3]，而幽門螺桿菌陽性個體中最豐富的菌群依次是幽門螺桿菌、變形桿菌、厚壁菌、放線菌[4]。幽門螺桿菌陽性可導致變形桿菌、螺旋菌及酸類桿菌豐度升高[5]。Andersson等[2]發現，在幽門螺桿菌陽性個體中，幽門螺桿菌占胃內微生物菌群的70%～95%。本研究結果顯示，幽門螺桿菌組灌胃后12個月胃內微生物菌群按照豐度排序依次是幽門螺旋桿菌、柔嫩梭菌、擬球梭菌、乳酸菌、普氏菌，對照組依次是擬球梭菌、乳酸菌、腸桿菌、柔嫩梭菌，說明幽門螺桿菌感染會引起大鼠胃內微生物菌群改變。

細菌的代謝產物可作為腫瘤細胞能量代謝的原料，在腫瘤發生、發展中具有重要作用。短鏈脂肪酸包括乙酸、丙酸及丁酸等，由細菌發酵碳水化合物衍生而來。丁酸是膳食纖維經胃腸道細菌發酵產生的代謝產物，屬于短鏈脂肪酸的一種，是體內丁酸鹽的主要有效成分。能夠產生丁酸的微生物統稱為丁酸鹽產生菌，主要由厚壁菌門、放線菌門、變形菌門、梭菌門、螺旋體門等微生物組成[7]。腸道內產丁酸鹽的細菌主要分布在厚壁菌門梭菌科中的梭菌屬，其中豐度最高的是柔嫩梭菌，其次是擬球梭菌[6]。研究發現，丁酸鹽可通過調節Treg細胞、NF-κB通路而影響炎癥反應，參與維持腸道上皮細胞完整性及內環境穩定性[8]。Belcheva等[9]研究發現，腸道微生態可以通過產生丁酸鹽，刺激結腸上皮細胞增殖、分化，從而導致結腸癌的發生。Qin等[10]采用16 S rRNA高通量測序方法發現，當腸道丁酸鹽產生菌增多以及菌群活動增強時，易誘發機體發生胰島素抵抗，從而導致2型糖尿病的發生。目前，大部分研究是關于丁酸鹽對結腸上皮細胞的影響，且結果具有爭議性[11,8]。丁酸鹽理論上可作為氧化能量和胃酸分泌過程中的氧化代謝來源[12]，但是目前關于丁酸鹽是否存在于胃黏膜上皮及其對胃癌發生的影響鮮見報道。本研究結果顯示，幽門螺桿菌組灌胃6個月胃組織丁酸水平即開始升高，灌胃12個月胃組織乙酸、丙酸、丁酸水平均高于對照組，其中丁酸水平升高最明顯；這與幽門螺桿菌組灌胃12個月丁酸鹽產生菌(柔嫩梭菌、擬球梭菌)豐度升高的結果相符合，提示微生物菌群豐度改變勢必導致微生物代謝產物的變化。

目前，關于丁酸鹽對消化道腫瘤細胞增殖能力影響的研究多集中于結腸癌細胞，且其影響存在爭議。Xu等[13]研究發現，丁酸鹽可通過增強miR-200c表達而抑制結腸腫瘤細胞增殖能力。Singh等[14]研究發現，丁酸鹽可激活Gpr109a，從而抑制結腸炎癥及結腸癌進展。Donohoe等[15]研究發現，丁酸鹽對結腸癌細胞增殖能力的影響取決于其濃度，在較低劑量(0.5、1.0 mmol/L)時丁酸鹽能夠促進結腸癌細胞增殖，而在高劑量(>1.0 mmol/L)時則呈現抑制作用。本研究結果顯示，丁酸鹽可促進胃癌細胞增殖和遷移，且在濃度為2.5 mmol/L時促增殖能力最強。

綜上所述，幽門螺桿菌感染可以導致小鼠胃組織中丁酸水平及產丁酸鹽的菌群豐度升高，而丁酸鹽可促進胃癌細胞增殖、遷移，這可能是幽門螺桿菌導致胃癌發生的機制之一。但本研究樣本量較小，尚需進一步擴大實驗標本、增加胃內微生物菌群構建數量及種類，為研究幽門螺桿菌對胃內微生態及微生物代謝組學的影響提供依據。