利福平緩解糖皮質(zhì)激素誘導ONFH的早期軟骨細胞凋亡的實驗研究

謝冰勇 陳紫璇 劉扶搖

[摘要] 目的 探討糖皮質(zhì)激素（Glucocorticoids，GC）對軟骨細胞的影響及利福平對其的保護作用。 方法 從SD大鼠的膝關節(jié)分離關節(jié)軟骨細胞進行細胞培養(yǎng)并用不同濃度的地塞米松（Dexamethasone，Dex）進行治療，按照隨機對照原則分為三組：NS（Con）組、Dex組和Dex+Rif組，測量軟骨細胞中的活性氧（Reactive oxygen species，ROS）水平和甲狀旁腺激素（Parathyroid hormone，PTH）/甲狀旁腺激素相關肽受體（Parathyroid hormone-related peptide receptor，PTH1R）的表達。進一步通過Western blot檢測研究軟骨細胞中凋亡相關蛋白的表達水平。 結(jié)果 GC處理后，軟骨下區(qū)出現(xiàn)空洞軟骨異常，破骨細胞活性增強，同時通過GC處理后ROS水平和PTH1R表達增加。在Dex+Rif組中，利福平保護了免受Dex誘導的軟骨細胞凋亡。 結(jié)論 ROS產(chǎn)生和PTH1R表達減少可使利福平減輕Dex處理軟骨細胞的凋亡，軟骨細胞的大量凋亡可能是早期ONFH的特征性標志。

[關鍵詞] 利福平;糖皮質(zhì)激素;股骨頭壞死;軟骨細胞

[Abstract] Objective To investigate impacts of glucocorticoids（GC） on chondrocytes and protection effects of rifampicin. Methods Chondrocytes were isolated from the knee joint of SD rats for cell culture and were administered by dexamethasone（Dex） at different concentrations. According to the principle of random control， the cells were randomly divided into three groups： The NS（Con） group， the Dex group and the Dex+Rif group. The level of reactive oxygen species（ROS） and expressions of parathyroid hormone（PTH）/ type 1 PTH-related peptide receptor （PTH1R） in chondrocytes were determined. Expressions of apoptosis-related proteins in chondrocytes were determined by western blot. Results After the treatment of GC， abnormally eroded cavities were formed in subchondral bone， accompanied by elevated osteoclast activity， as well as increased levels of ROS and PTH1R in chondrocytes. Rif protected chondrocytes against Dex-induced cell apoptosis in the Dex+Rif group. Conclusion Rif repressed Dex-induced chondrocyte apoptosis via ROS generation and PTH1R down-regulation. A high amount of chondrocyte apoptosis could be a typical picture of early osteonecrosis of the femoral head（ONFH）.

[Key words] Rifampicin; Glucocorticoids; Osteonecrosis of the femoral head; Chondrocytes

股骨頭壞死（Osteonecrosis of the femeral head，ONFH）經(jīng)常導致股骨頭的進行性塌陷變形[1]，而GC給藥導致的激素性ONFH是非創(chuàng)傷性中最常見的危險因素，多發(fā)生于35～55歲的青壯年，男性多于女性[2]。軟骨細胞的凋亡和壞死等異常情況通常被認為是ONFH的特征性標志之一。目前，ONFH的發(fā)病機制仍不清楚，是國內(nèi)外骨壞死研究的熱點[3]。在許多研究中已經(jīng)報道了關于GC誘導軟骨細胞的凋亡和壞死等異常情況對ONFH的影響[14]。Liu LH等[4]通過在GC誘導的ONFH中，發(fā)現(xiàn)在癥狀出現(xiàn)之前，可以診斷軟骨壞死，尤其是通過磁共振成像（MRI），但在早期階段仍沒有令人滿意的治療ONFH的方法。如果早期階段的變化得到明確說明，治療方法及效果將會更好。由于GC誘導的生長遲緩與軟骨細胞的凋亡增加有關[5]，本研究在ROS水平和PTH/PTH1R與細胞凋亡有關的基礎上，假設GC誘導的細胞凋亡與ROS水平升高和PTH1R表達有關，通過體外研究軟骨細胞，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 試劑和材料

SD大鼠18只、不同濃度Dex（10-7～10-4 M）利福平、10%胎牛血清（FBS）、抗生素DMEM/F12;培養(yǎng)基5×103細胞/孔、CCK-8（Dojindo Laboratory，Kumamoto，Japan）、PI/Hoechst混合物（Beyotime生物技術研究所，中國江蘇）、10 μmol/L DCFH-DA、兔抗鼠Caspase-3抗體、PTH1R抗體、羊抗兔熒光抗體、DAPI;SDS-PAGE（10%聚丙烯酰胺凝膠）。

1.2 關節(jié)軟骨細胞培養(yǎng)和處理

18只雄性SD大鼠（3月齡，200～250 g）隨機分成3組，NS（Con）組6只，Dex組6只，Dex+Rif組6只。通過培養(yǎng)SD大鼠股骨頭軟骨細胞，取股骨頭軟骨。該程序經(jīng)徐州醫(yī)科大學動物實驗倫理委員會[SYXK（jiangsu）2016-0028]批準。根據(jù)夏韶襁等[6]所用的方法從大鼠的膝關節(jié)分離關節(jié)軟骨細胞進行細胞培養(yǎng)和治療。將軟骨細胞在補充有10%FBS和抗生素DMEM/F12的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在該研究中，原代細胞維持在單層培養(yǎng)中，當細胞達到匯合后，將不同濃度的Dex加入含有或不含利福平的培養(yǎng)基中，每個實驗至少重復3次。

1.3 細胞活力測定

將ROS水平以5×103細胞/孔的密度接種細胞并使其粘附過夜，第二天加入Dex，范圍10-7～10-4 M。通過CCK-8在24 h、48 h和72 h測量活細胞量。根據(jù)說明書要求，將PI/Hoechst混合物添加到培養(yǎng)板中用于細胞凋亡檢測。使用DCFH-DA探針測定細胞內(nèi)ROS水平。將細胞置于含有或不含有利福平（0.5 μg/mL）的Dex中暴露72 h。暴露后，向培養(yǎng)物中加入10 μmol/L DCFH-DA，然后在黑暗中孵育30 min。用488 nm的激發(fā)波長和525 nm的發(fā)射波長測量熒光強度。

將細胞接種在蓋玻片上并在Dex組和Dex+Rif組的Dex中培養(yǎng)72 h并進行免疫熒光分析，然后固定細胞并封閉表位，將兔抗鼠Caspase-3或PTH1R抗體加入細胞中并在4℃溫育過夜。然后，加入羊抗兔熒光抗體和DAPI，并在室溫下溫育1 h。通過顯微鏡（ZEISS，AXIO）觀察樣品。

1.4 提取細胞中蛋白質(zhì)樣品蛋白質(zhì)印跡分析

通過SDS-PAGE（10%聚丙烯酰胺凝膠）分級分離50～100 μg蛋白質(zhì)樣品和western blot[7]使用以下一抗：Caspase-3（1：1000）、Bcl-2（1：1000）、P62（1：1000）、Beclin-1（1：1000）、LC3（1：1000）、PTH1R（1：100）和β-肌動蛋白（1：1000）。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計學軟件進行分析，全部數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 GC誘導慢性細胞凋亡、ROS水平及PTH1R表達的變化

研究caspase-3和Bcl-2的表達以評估GC誘導的細胞凋亡。這與軟骨細胞的體細胞腔一致，同時在這些細胞周圍檢測到caspase-3的表達，而Bcl-2的表達在Dex+Rif組中最低，幾乎不能檢測到（封三圖3）。另外，數(shù)據(jù)顯示，Dex增加了ROS活性水平，利福平逆轉(zhuǎn)了這種效應，而在PTH1R的表達中發(fā)現(xiàn)了類似的效果（封三圖4）。

2.2 Dex處理對軟骨細胞的抑制作用和細胞凋亡誘導作用

測試一系列Dex濃度以確定軟骨細胞的活力。在48 h處理后，細胞的存活率在濃度10-4 M的Dex時顯著降低。但是在濃度10-5 M的Dex處理下，在72 h后觀察到顯著的活力降低，并觀察到細胞形態(tài)變化（封三圖5-A）。此外，在一系列Dex濃度下研究了細胞凋亡和自噬標志。蛋白質(zhì)印跡分析表明，將蛋白質(zhì)LC-3Ⅱ在85.7%的水平（封三圖5-C）和Caspase-3在70.6%的水平（封三圖5-D），相對于β-Actin條帶密度進行標準化后，發(fā)現(xiàn)濃度在0 M到10-5 M Dex時caspase-3、LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白水平以劑量依賴性方式顯著增加（P=0.006），其中LC-3Ⅱ增加約2.2倍，Caspase-3增加約1.8倍（表1），但Bcl-2的表達相反（封三圖5-B）。

2.3 利福平逆轉(zhuǎn)GC誘導的軟骨細胞凋亡、PTH1R表達的變化

通過研究利福平對Dex誘導的軟骨細胞凋亡的影響，將NS（Con）組、Dex組與Dex+Rif組一起培養(yǎng)3 d。如封三圖6-A所示，NS（Con）組和Dex+Rif組軟骨細胞凋亡率和壞死率均低于Dex組軟骨細胞（P=0.007），通過利福平培養(yǎng)時這些比率顯著下降（P=0.004），進一步說明利福平逆轉(zhuǎn)了GC誘導的軟骨細胞凋亡。同時，caspase-3的表達和蛋白質(zhì)印跡分析進一步證實了這種效果（封三圖6-B）。在細胞凋亡和壞死的進程中（封三圖6-C），NS（Con）組的軟骨細胞凋亡率為0.89%，壞死率為1.75%;Dex+Rif組的軟骨細胞凋亡率為1.74%，壞死率為2.10%;而Dex組的軟骨細胞凋亡率高到8.32%，壞死率高達5.00%，其是Dex+Rif組軟骨細胞凋亡率的4.78倍，壞死率也達2.4%。同時，在10-5 M Dex的處理下（封三圖6-D），Dex組陽性軟骨細胞率均達到NS（Con）組和Dex+ Rif組的5倍之多（表2）。可見利福平有效地干預并降低了糖皮質(zhì)激素Dex誘導的ONFH。另外，通過研究PTH1R對軟骨細胞表達的影響發(fā)現(xiàn)，72 h后，在Dex組中，Dex增加了PTH1R的表達，而在Dex+Rif組中利福平明顯降低軟骨細胞中PTH1R的表達。蛋白印跡數(shù)據(jù)分析進一步證實了這種作用（封三圖7）。

3 討論

據(jù)報道，Dex處理可增加成骨及軟骨細胞的凋亡[5]。而除骨細胞、成骨細胞和骨髓細胞外，GC誘導的ONFH也傾向于發(fā)生軟骨細胞凋亡[8]，類似的現(xiàn)象在本研究的股骨頭軟骨細胞中得到證實。本研究通過GC治療SD大鼠的股骨頭壞死，沒有明顯檢測到空的骨細胞腔，但發(fā)現(xiàn)軟骨下區(qū)域的軟骨空缺和生長板的破壞比正常明顯，這不僅可以解釋為骨轉(zhuǎn)換正常，這些變化更可能是由于生長板的修復過程造成的。Iwaniak P等[9]發(fā)現(xiàn)，GC處理后發(fā)生生長遲緩的特征在于軟骨細胞的增殖減少及加速膠原纖維的成熟。同時，本研究也發(fā)現(xiàn)PTH1R的表達與caspase-3的表達一致。Dex+Rif組中尤其是軟骨細胞周圍的caspase-3表達增加，而Bcl-2的表達則明顯降低。此外，PTH/PTH1R之間的相互作用平衡對于軟骨細胞分化的速度至關重要。支持PTH/PTH1R在延遲生長板發(fā)育中的作用，可能是通過激活cAMP依賴性信號級聯(lián)反應[10]。另外，Maycas M等[11]報道通過不依賴PTH和依賴性機制的PTH1R激活，使得在軟骨細胞中的機械刺激存活作用中具有重要作用，其受到了PTH治療的同源下調(diào)控制，但不受無關的激動劑如胰島素樣控制生長因子（IGF）-I[12]控制。Dex還在成骨細胞樣細胞和間充質(zhì)干細胞中上調(diào)PTH1R[13]，這與Dex誘導的ROS應激和caspase-3活化與軟骨細胞中PTH1R的上調(diào)一致。基于以上數(shù)據(jù)，可以假設GC誘導的軟骨空腔隙破壞以及Bcl-2下調(diào)和軟骨細胞的凋亡，可以通過增加PTH1R的表達來介導。另外，評估ROS水平，發(fā)現(xiàn)GC誘導的ROS應激可能啟動細胞凋亡。

另外，Dex10-7～10-4 M的濃度下進行測試發(fā)現(xiàn)細胞毒性對軟骨細胞的影響非常高，特別是在10-5 M Dex和10-4 M Dex。評估ROS水平，發(fā)現(xiàn)GC誘導的ROS應激可能啟動細胞凋亡，這與在Dex+Rif組中，利福平逆轉(zhuǎn)Dex誘導的軟骨細胞凋亡和ROS水平及PTH1R表達的增加類似，可見利福平顯示出對GC誘導的凋亡的拮抗作用（封三圖3），同時也觀察到ROS水平降低。另外，在細胞自噬過程中，薛恩興[14]通過實驗表明，GC激活軟骨細胞中的自噬，并同時誘導軟骨細胞的衰老。細胞可能在代謝應激期間保持活力，自噬被認為是軟骨細胞的自我保護機制[15]。本研究在軟骨細胞中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。

最后，本研究也發(fā)現(xiàn)GC處理后軟骨細胞凋亡與ROS水平和PTH1R的表達相關，而GC誘導增強的破骨細胞活性通常位于這些凋亡的軟骨細胞周圍。同時，GC可誘導ROS水平升高，PTH1R表達和軟骨細胞凋亡發(fā)生以及周圍破骨細胞活性增強。然而，隨著PTH1R的上調(diào)和自我修復能力的增加，骨形成性增加，推測會發(fā)生軟骨內(nèi)骨化的恢復，特別是來自周圍的軟骨細胞或生長板。因此，隨著細胞凋亡和骨溶解的增長，壞死區(qū)域最終發(fā)展形成。相反，硬化區(qū)的形成可能是由于PTH1R的上調(diào)和周圍環(huán)境的自我修復能力。目前，國內(nèi)關于利福平緩解糖皮質(zhì)激素誘導ONFH的早期軟骨細胞凋亡的報道較少，本研究具有一定的創(chuàng)新性。

總之，GC處理SD大鼠后發(fā)現(xiàn)軟骨細胞異常凋亡，利福平減少了Dex誘導的細胞凋亡、ROS產(chǎn)生和PTH1R表達。鑒于缺血誘導和GC誘導的ONFH之間存在密切關系，因此，軟骨細胞的大量凋亡可能被認為是ONFH早期的特征性標志，PTH1R的表達可能在骨壞死的發(fā)展中起重要作用。

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（收稿日期：2019-11-15）