女貞子提取物干預大鼠膝骨關節炎的實驗研究?

陳春雯 嚴 波 單樂天 王春雷 周 莉△

（1.浙江中醫藥大學，浙江 杭州 310053；2.浙江大學醫學院附屬杭州市第一人民醫院，浙江杭州 310000；3.浙江省腫瘤醫院，浙江 杭州 310022）

骨關節炎（OA）是臨床常見的關節疾病，有15%～40%的60歲及以上人群受其影響［1-2］。隨著人口老齡化的加劇和肥胖率的上升，OA的患病率逐年增加［3］。女貞子是木樨科植物女貞子的干燥成熟果實，最初記錄于《神農本草經》，主要用于治療骨質疏松癥、關節炎和骨痛等年齡相關的疾病［4-5］。在中醫學中，女貞子被認為是具有補腎活血的可食用草本植物，可有效治療腰膝酸軟［6］。根據中醫的理論和臨床經驗，腎虛與骨關節疾病發病有關，補腎活血可促進骨代謝和形態的發生［7］。許多補腎活血的中藥已經臨床用于治療OA，取得了積極的效果［8-9］。有研究表明，滋陰補腎法代表方二至丸（由女貞子和墨旱蓮2味中藥組成）通過調節雌二醇（E2）和C反應蛋白（CRP）的表達，能改善軟骨細胞功能，減輕滑膜炎癥，從而改善絕經后膝骨關節炎（KOA）的癥狀，將可能開辟治療KOA的有效新途徑［10］。本研究通過動物實驗觀察女貞子提取物對KOA病變中疼痛和軟骨損傷的影響，初步對其作用機制進行探究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級健康雄性SD大鼠32只，體質量180～220 g，上海斯萊克實驗動物有限公司提供，浙江中醫藥大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（浙）2013-0016。

1.2 藥物及試劑

女貞子（浙江天道醫藥有限公司，批號17072201），稱取女貞子粉末100 g置于1 000 mL的圓底燒瓶中，加入10倍量的純水浸泡30 min，加熱回流提取60 min，濾過收集煎液，向殘渣加入8倍量的純水，再加熱回流提取60 min，濾過，合并2次煎液，真空減壓濃縮至1 g/mL，即得女貞子水提液，水提液以5 000 r/min離心10 min，取上清液冷凍干燥成粉末備用。戊巴比妥鈉粉劑（中國醫藥集團上海化學試劑公司）。0.9%氯化鈉注射液（中國大冢制藥有限公司，批號5G70J3）、番紅O染色液（美國Sigma公司）、4%多聚甲醛溶液（中國Solarbio公司）、乙二胺四乙酸（EDTA）（中國Solarbio公司）、碘乙酸鹽（MIA）（美國Sigma公司）、Ⅱ型膠原酶（美國Worthington）、IMDM培養液（美國Gibco公司）、0.25%EDTA-胰蛋白酶（美國Gibco公司）、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）粉末（Sigma公司，美國）、二甲亞砜（DMSO）溶液（美國Sigma公司）、胎牛血清（FBS）（美國Gibco BRL，Grand Island，NY）、PBS（美國Phosphate Buffered Saline，Gibco公司）、檸檬酸鈉緩沖液（中國北京市中衫金橋生物技術有限公司）、中性樹膠封片劑（中國北京博奧森生物技術有限公司）、Triton X-100（美國Sigma-Aldrich公司）、SYBR熒光定量試劑盒（中國Takara公司）、反轉錄試劑盒（中國Takara公司）、山羊血清（中國Solarbio公司）、4%多聚甲醛（中國Solarbio公司）、引物（中國上海市生工生物工程股份有限公司）、抗體（美國Danvers，MA）。

1.3 實驗儀器

倒置YLS-3E電子壓痛測定儀（中國安合盟天津科技發展有限公司）、DK-S12型恒溫水浴鍋（上海森信實驗儀器有限公司）、SW-CJ-1F層流超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）、AXiovert200熒光倒置顯微鏡（BX20）（日本Olympus公司）、全自動多功能酶標儀（美國BioTek公司）、二氧化碳細胞培養箱（3111）（美國Thermo公司）。

1.4 分組與造模

32只SD大鼠稱體質量后隨機分組、編號，分為正常組、模型組、女貞子灌胃組、女貞子注射組，每組8只。大鼠膝骨關節炎疼痛模型采用碘乙酸關節腔注射造模法。對正常組大鼠雙側后肢膝關節腔內各注射50 μL 0.9%氯化注射液，其他組大鼠均通過向雙側后肢膝關節腔內注射50 μL MIA（30 mg/mL），建立大鼠KOA疼痛模型［11］。

1.5 干預方法

造模成功后，女貞子灌胃組采用女貞子提取物3.5 g/kg［10］灌胃處理，女貞子注射組采用關節腔內注射給藥方式，向大鼠膝關節腔注射50 μL女貞子提取物（100 μg/mL），正常組和模型組大鼠雙側后肢膝關節腔內各注射50 μL 0.9%氯化注射液。治療持續4周，于末次給藥后1周測定行為學數據。治療結束后，大鼠麻醉處死，進行膝關節取樣。

1.6 大鼠軟骨細胞提取

采用膠原酶和胰蛋白酶連續消化法分離3周齡SD大鼠（n=4）膝關節軟骨細胞。將收集的軟骨片切成1 mm3小塊，用0.25%胰蛋白酶在37℃水浴鍋內消化40 min，0.2%Ⅱ型膠原酶消化4 h。收集的細胞液用細胞篩（70 μm）過濾，離心棄上清。培養基（IMDM內添加10%胎牛血清和1%抗生素）重懸軟骨細胞，置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養，每2日更換1次培養基。當軟骨細胞達到80%融合后傳代，備用。

1.7 指標測定

1.7.1 壓痛測定 應用YLS-3E電子壓痛儀測定大鼠的痛閾。將大鼠裝入固定桶內，使其處于舒適又固定的狀態，用扁形頭對大鼠雙側后足背施壓，當大鼠因疼痛出現鳴叫或掙扎時顯示的壓力值即為此大鼠的痛閾值。實驗開始前測定基礎痛閾，于造模后的第4周測定痛閾。

1.7.2 組織病理學分析 造模給藥4周后，將大鼠麻醉處死，切取所有大鼠的膝關節，標記后在4%多聚甲醛中固定72 h，用10%EDTA脫鈣液處理。連續處理8周后，進行脫水處理，包埋于石蠟中。切片后番紅O染色，常規脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察、拍照。根據Mankin′s評分系統［12］，通過雙盲觀察在0～13的等級上進行評分分級。

1.7.3 免疫組織化學染色 取膝關節組織石蠟切片，烤片2 h，切片常規脫蠟至水后，分別加常規抗原修復液和骨組織抗原修復液進行抗原修復，然后用3%H2O2室溫孵育30 min，用10%山羊血清封閉30 min，滴加TBS稀釋的一抗Col2（1∶100），4 ℃孵育過夜，次日滴加辣根過氧化物酶標記的二抗，DAB顯色，蘇木精復染，常規脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察、拍照。

1.7.4 女貞子提取物對大鼠原代軟骨細胞的影響 將細胞以5×103個/孔的密度接種于96孔板內，待細胞貼壁后進行給藥處理。分別加入不同質量濃度（0、5、10、15、25、50、100、200 μg/mL）女貞子提取物，于培養箱中分別培養24 h和48 h后進行MTT活性檢測。在避光環境中，向每個孔中加入10 μL MTT溶液（5.0 mg/mL）并在37℃孵育4 h。小心棄去孔內培養液，向每個孔中加入150 μL DMSO，置于搖床上低速振蕩10 min，使紫色結晶物充分溶解。用酶標儀在490 nm處測量光密度值（OD），計算增殖率，增殖率（PR）=（女貞子處理的OD/未處理的OD）×100%。

1.7.5 Real-time PCR分析 將第2代大鼠原代軟骨細胞消化計數后，以5×105個/皿均勻接種于6 cm的細胞培養皿中，培養24 h后，隨機分為3組：對照組、TNF-α組、TNF-α+女貞子組。TNF-α組和TNF-α+女貞子組預先用TNF-α（10 ng/mL）處理6 h。TNF-α+女貞子組加入女貞子提取物（100 μg/mL），置于培養箱中培養24 h。提取細胞核酸后使用Nano Drop超微量分光光度計測定RNA濃度。根據TAKARA逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA，采用SYBR反應體系進行Real-time PCR反應，每個樣本設3個復孔，以Actin作內參，檢測各組MMP13、Col10、Col2、Aggrecan的表達水平，目標基因序列見表1，各基因mRNA表達用2-ΔΔCt計算結果來表示。

表1 目標基因引物序列

1.8 統計學處理

2 結 果

2.1 各組大鼠行為學觀察

見表2。模型組的壓痛閾值較正常組顯著下降（P＜0.01）；女貞子注射組與模型組比較有顯著提高（P＜0.01）；女貞子灌胃組與模型組比較有所提高，但差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠壓痛閾值比較（g，±s）

表2 各組大鼠壓痛閾值比較（g，±s）

與模型組比較，?P＜0.01

正常組模型組女貞子灌胃組女貞子注射組8 8 8 8 266.60±26.99 255.00±41.01 240.50±16.39 255.30±19.69 279.13±19.29*108.88.±12.03 157.25±26.92 216.29±35.09*

2.2 各組大鼠膝關節軟骨組織形態學觀察

見圖1。組織病理學結果顯示，模型組的Mankin′s評分為（4.39±1.42）分，高于空白組的（1.23±1.01）（P＜0.01）；女貞子注射組Mankin′s評分為（1.77±0.73）分，較模型組顯著下降（P＜0.01）；女貞子灌胃組（3.33±1.32）分，與模型組比較有所下降，但差異無統計學意義（P＞0.05）。女貞子注射組治療后明顯增加了軟骨表面的軟骨細胞數量，改善了軟骨細胞排列和膠原質量。

2.3 各組大鼠膝關節軟骨組織Col2觀察

見圖2。模型組軟骨表達的Col2量少于正常組，女貞子灌胃和注射組的Col2表達趨于正常。

圖1 各組大鼠膝關節軟骨組織病理學觀察（SO染色，比例尺=40 μm）

圖2 各大鼠軟骨中Col2表達的免疫組織化學觀察（200倍）

2.4 各組大鼠膝關節軟骨細胞活性比較

見表3。通過MTT法評估女貞子提取物對大鼠軟骨細胞的增殖作用。劑量范圍為5～200 μg/mL的女貞子提取物顯著增加了軟骨細胞的細胞活力，細胞增殖率在給藥24 h后從0.6%增加到53.1%，48 h后從40.5%增加到78.0%。

表3 各組大鼠膝關節軟骨細胞活性比較（%，±s）

表3 各組大鼠膝關節軟骨細胞活性比較（%，±s）

女貞子質量濃度5 μg/mL 10 μg/mL 15 μg/mL 25 μg/mL 50 μg/mL 100 μg/mL 200 μg/mL給藥后24 h 0.58±3.31 8.51±3.16 14.76±10.74 31.82±7.17 38.50±10.17 54.23±16.98 53.09±5.11給藥后48 h 40.50±15.55 54.93±14.37 61.55±14.70 67.06±9.60 75.74±8.03 81.64±15.50 78.03±10.08

2.5 各組軟骨細胞中OA相關基因表達水平比較

見表4。用TNF-α預處理軟骨細胞以模擬OA病理狀態。與正常組相比，TNF-α組顯著上調Col10、MMP13的表達，下調Col2和Aggrecan的表達（P＜0.05或P＜0.01）。在女貞子處理24 h后，與TNF-α組相比，這些基因的異常表達向正常水平逆轉（P＜0.05或P＜0.01）。

表4 各組軟骨細胞中OA相關基因表達比較（±s）

表4 各組軟骨細胞中OA相關基因表達比較（±s）

與正常組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與TNF-α組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別正常組TNF-α組TNF-α+女貞子組Col10 mRNA 1.01±0.17 1.39±0.03##1.22±0.05#*Col2 mRNA 1.00±0.02 0.79±0.03##1.07±0.05##**Aggrecan mRNA 1.00±0.02 0.70±0.02##0.80±0.07##**Mmp13 mRNA 1.00±0.02 2.33±0.21##0.82±0.05##**

3 討論

OA屬于中醫學“骨痹”范疇，本病發病多因肝血不足、腎元虧虛、血脈瘀滯，致骨失其所養，筋骨不堅，瘀血內阻或兼有外邪侵襲，經脈痹阻而致。中醫藥治療OA的原則是補腎活血、強筋健骨、舒筋活絡。臨床中的辨證分型主要集中在風寒濕阻、氣滯血瘀、痰瘀互結、痰濕阻絡和肝腎虧虛等證型，在治療上應采用補益肝腎、強腰健膝的中藥。女貞子性涼，味甘、苦，歸肝、腎經，具有滋補肝腎、明目烏發之功效，可用于治療眩暈耳鳴、腰膝酸軟、須發早白、目暗不明等癥。現代藥理實驗表明，滋補腎陰中藥能提高血清雌二醇水平，而雌激素水平降低與骨性關節炎的發生顯著相關［10］。因此，女貞子具有被開發為抗骨關節炎藥物的潛力。

局部關節內注射治療是KOA保守治療的代表方法。由于KOA病變僅存在于關節中，因此通過關節內注射途徑施用的局部治療是合適的策略。1951年，Hollander及其同事首次在關節炎中引入關節內注射治療［13］，后來IA治療被美國食品藥品管理局（FDA）和歐洲藥品管理局（EMA）批準。與常規口服給藥相比，該技術避免了全身暴露和潛在的不良副作用。實際上，關節內注射具有許多內在特征，這可能比系統療法更有優勢：增加的生物利用度和安全性，更低的藥物劑量和全身毒性，可避免的常規聯合進入障礙和積極的安慰劑益處［14］。此外，它是一種相對簡單且耐受性良好的程序，其恢復時間最短，可用作口服生物利用度低的藥物的替代方式［15-16］。臨床試驗證明，IA療法是KOA患者的一種替代和安全的治療方法，與常規治療相比，患者因不良事件而退出治療的比例較低［17-18］。關節內注射是一種創新方式，可能有助于提高中醫療法的有效性和安全性。

研究發現關節腔注射云南白藥，能通過抑制滑膜組織中降鈣素基因相關肽（CGRP）陽性神經細胞的增生和巨噬細胞抗原（ED1）陽性炎癥細胞數量，對KOA疼痛和炎癥有明顯的治療作用［19］。研究發現通過膝關節關節腔注射鳳凰衣水解物降低膝骨關節炎大鼠的炎癥因子表達，提高關節軟骨中蛋白多糖和Collagen-Ⅱ含量，對改善關節液炎癥指標效果更好［20］。本實驗通過比較女貞子提取物灌胃和關節腔注射治療大鼠KOA，評估不同給藥方式對女貞子抗OA作用的影響。結果表明，女貞子關節腔注射能明顯減輕關節疼痛，而女貞子灌胃治療對OA大鼠減輕疼痛的效果不如女貞子注射組。同樣在大鼠軟骨組織病理Mankin′s評分中，女貞子灌胃組和女貞子注射組低于模型組，女貞子注射組治療效果優于女貞子灌胃組，女貞子提取物關節腔注射有明顯的治療效果。關節腔注射女貞子提取物直入靶點，作用明確，效果顯著。

在本研究中，免疫組織化學分析顯示女貞子的潛在機制與軟骨中Col2表達的調節相關。以100 μg/mL的女貞子提取物進行體外實驗評估，RT-PCR測定進一步闡明了女貞子不僅逆轉了Mmp13、Col2和Col10的異常表達，還恢復了TNF-α處理的軟骨細胞中Aggrecan的表達。本實驗研究結果揭示了女貞子有抗OA作用，并闡明了與抑制軟骨細胞肥大和分解代謝相關的分子機制。

只有一種動物模型不足以完全明確女貞子的藥理學特征。因此，需要進一步的研究來驗證女貞子對其他OA模型的抗OA作用。本研究嘗試將關節內注射與中醫治療相結合，為補充傳統治療策略提供了另一種治療方案。口服是中醫治療的傳統途徑。目前對關節內注射與口服之間差異的認識在中醫藥領域還很有限，需要更大規模的長期研究來獲得更積極的結果，進一步證實關節內注射中藥治療的適用性。本實驗通過RT-PCR分析評估女貞子對軟骨細胞的體外作用，闡明了其與TNF-α處理的軟骨細胞中Mmp13、Col2、Col10和Aggrecan的基因表達相關的機制，并未明確其具體信號通路，仍需要進一步的研究。