石榴花不同萃取部位對胰島素抵抗的影響及作用機制研究

李 彤，金 晨，熊 瑤，程玉瑤，陳 康，戴隆程，張 凌

(江西中醫藥大學 1. 藥學院，2. 現代中藥制劑教育部重點實驗室，江西 南昌 330004)

2型糖尿病是一種以高血糖、胰島素抵抗為主要特點的疾病，改善機體胰島素抵抗是治療2型糖尿病的主要途徑之一[1]。維吾爾族藥“古麗娜”，即石榴花(pomegranate flower)是石榴科落葉灌木或小喬木石榴PunicagranatumL.的干燥花瓣，有良好的抗2型糖尿病及并發癥、保護循環系統、抗炎、抗氧化、保肝等作用[2-3]，但其抗2型糖尿病的活性成分與作用機制尚不明確。以高脂飲食和鏈脲佐菌素誘導的2型糖尿病大鼠及胰島素抵抗的3T3-L1脂肪細胞為研究對象，探討石榴花不同萃取部位對胰島素抵抗的影響及作用機制，為石榴花在2型糖尿病中的應用提供實驗依據。

1 材料

1.1 藥物與試劑石榴花藥材購自新疆和田，經新疆醫科大學蘭衛教授鑒定為石榴科石榴屬植物石榴Punicagranatum L.的干燥花瓣；鏈脲佐菌素(streptozocin, STZ, Lot WXBC2544V)購自美國Sigma公司；葡萄糖測定試劑盒(Lot 20190508231)購自上海榮盛生物藥業有限公司；糖化血清蛋白(GSP,Lot 20180828)、總膽固醇(TC, Lot 20180825)、甘油三酯(TG, Lot 20180825)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C, Lot 20180825)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C, Lot 20180825)、還原型谷胱甘肽(GSH, Lot 20180824)、丙二醛(MDA, Lot 20180828)測定試劑盒、血清胰島素(FINS)測定試劑盒(Lot R20180829)均購自南京建成生物工程研究所；CCK-8試劑盒, Lot 091918181104)購自上海碧云天公司；胎牛血清(FBS, Lot 072419190816, 上海碧云天公司分裝)、DMEM高糖培養基(Lot 8119058)購自美國Gibco公司；PPARγ(Lot 8FIE5DBC, Akt(Lot 00071929, Akt-phospho-s473(Lot 10011010, PI3K(Lot 10005702, Glut4(Lot 0057210)antibody購自ProteinTech公司；β-actin(Lot N20610、 N10610、N10528)、顯影液(Lot M20926)購自北京全式金公司。

1.2 實驗動物SPF級SD雄性大鼠60只，體質量(200±20)g，購自江西中醫藥大學動物實驗科技中心，合格證號為SCXK(贛)2018-0003。動物飼養于江西中醫藥大學動物實驗科技中心SPF級環境中，12 h/12 h日夜循環條件，自由采食，室溫(22±2) ℃，相對濕度為45%～55%，適應性喂養1周后開始實驗。

1.3 細胞株3T3-L1前脂肪細胞，由中國科學院細胞庫提供。

1.4 儀器酶標儀(美國Thermo公司)、電泳儀(北京六一實驗儀器有限公司)、顯影儀(德國AnalytikJena公司)。

1.5 給藥溶液的提取與制備取8 kg干燥的石榴花藥材用高效多功能粉碎機粉碎，60%乙醇加熱回流提取2次，每次60 min，提取液合并后過濾，(50～60) ℃加熱減壓濃縮制得石榴花總提物浸膏，留取部分浸膏，剩下浸膏加入適量雙蒸水混懸，分別用二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取至有機溶劑呈無色，萃取后剩余為水部位，回收溶劑得各部位浸膏[4]，所得浸膏進行冷凍干燥，提取率為58.93%，分別得乙酸乙酯、正丁醇、水部位浸膏163.33、867.70、3 617.55 g，于-20 ℃保存，臨用現配，精密稱定后用雙蒸水稀釋至所需濃度。

2 方法

2.1 動物實驗

2.1.12型糖尿病模型的建立 高脂飼料(豬油16.9%、蔗糖14%、酪蛋白10.2%、預混料2.1%、麥芽糊精2.2%、普通繁殖鼠料54.6%)喂養大鼠6周，禁食12 h后腹腔注射35 mg·kg-1STZ(溶于pH 4.5的0.1 mol·L-1檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，注射前配制，避光使用)，正常組同期腹腔注射等量的檸檬酸緩沖液。造模7 d后禁食12 h，尾靜脈采血測定空腹血糖，空腹血糖(FPG)>11.1 mmol·L-1則為造模成功，若造模不成功則補注35 mg·kg-11% STZ 1次。

2.1.2分組與給藥 將造模成功的SD大鼠分為模型對照組、陽性對照組及各部位給藥組，未造模大鼠為空白對照組，每組10只，在造模成功后給藥組分別給予石榴花乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位提取物250 mg·kg-1，陽性對照組給予二甲雙胍200 mg·kg-1，空白對照組、模型對照組給予同體積蒸餾水，每日1次，連續給藥4周。

2.1.3血糖測定 分別于給藥前和給藥4周后禁食12 h，尾靜脈采血測定FPG。

2.1.4生化指標測定 給藥d 28進行腹主動脈取血，室溫靜置2 h后，室溫3 500 r·min-1離心分離血清，分裝后于-80 ℃保存用于生化指標的測定。根據試劑盒說明書測定血清中GSP、TC、TG、HDL-C、LDL-C、GSH、MDA含量，ELISA方法測定FINS，并采用李光偉計算方法計算胰島素敏感指數(insulin sensitivity index，ISI)和胰島素抵抗指數(homeostasis model assessment-insulin resistance index，HOMA-IR)，ISI=Ln[1/(FPG·FINS)][5]，HOMA-IR=FPG·FINS/22.5[6]。

2.2 細胞實驗

2.2.1胰島素抵抗(IR)模型的建立 用0.1%的明膠包被培養瓶，使用10% FBS的DMEM高糖培養基將3T3-L1前脂肪細胞培養于37 ℃、5% CO2飽和濕度的細胞培養箱中，待細胞長至80%～90%時更換培養液，細胞融合48 h后更換誘導液Ⅰ(含0.5 mmol·L-13-異丁基-1-甲基黃嘌呤、1 μmmol·L-1地塞米松、10 mg·L-1牛胰島素的完全培養基)培養96 h，誘導分化培養基Ⅱ(含10 mg·L-1牛胰島素的完全培養基)培養48 h，完全培養基培養48 h至細胞分化為成熟的脂肪細胞，80%～90%細胞分化成功后將細胞分別接種于6孔板、96孔板，待細胞貼壁后，加入含1 μmmol·L-1地塞米松的完全培養基培養96 h[7]，每48 h更換培養基。

2.2.2分組及給藥 按2.2.1中方法分化、接種細胞，空白對照組以完全培養基培養細胞，模型對照組、陽性對照組及給藥組給予含1 μmmol·L-1地塞米松的完全培養基，同時，陽性對照組給予10 μmol·L-1羅格列酮，給藥組分別給予不同濃度石榴花總提物、乙酸乙酯、正丁醇、水部位提取物。

2.2.3成熟脂肪細胞的鑒定 油紅O染色法鑒定成熟的脂肪細胞。棄舊培養基，PBS洗2次，加入4%多聚甲醛固定液固定25 min，棄去固定液，蒸餾水洗2次，60%異丙醇浸洗5 min至間質清晰，棄異丙醇，加入油紅O染色液浸染15 min，棄染色液，蒸餾水洗2～5次至無多余油紅O染色液，加入蒸餾水覆蓋細胞，顯微鏡下觀察與鑒定。

2.2.4細胞活力測定 按2.2.1中方法分化、接種細胞于96孔板中，待其貼壁后分別給予0、5、10、20、40、80 mg·L-1石榴花乙酸乙酯、正丁醇、水部位提取物培養96 h，每48 h換液1次，每個濃度4個復孔，給藥96 h后用CCK-8試劑盒測定細胞活力。

2.2.5細胞葡萄糖消耗量測定 按2.3.1中方法分化、接種細胞于96孔板中，建立胰島素抵抗模型，給藥組給予5、10、20 mg·L-1石榴花乙酸乙酯、正丁醇、水部位提取物，每48 h換液1次，每個濃度4個復孔，采用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法測定給藥0、96 h時上清液中葡萄糖含量，葡萄糖消耗量=葡萄糖含量0 h-葡萄糖含量96 h。

2.2.6Western blot方法測定細胞中蛋白表達 IR模型3T3-L1脂肪細胞給藥20 mg·L-1后棄舊培養基，PBS洗2次，用含1 mmol·L-1PMSF和蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液冰上裂解細胞30 min，1 000g，4 ℃離心5 min，取上清，BCA法測定蛋白濃度，加入loading buffer于-20 ℃保存。用時取各組30 μg蛋白樣品上樣，10% SDS-PAGE膠電泳分離蛋白，轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉或BSA室溫搖床封閉1 h，Akt(1 ∶2 000)、p-Akt(1 ∶5 000)、PPARγ(1 ∶2 000)、PI3K(1 ∶5 000)、Glut4(1 ∶300)、β-actin(1 ∶5 000)抗體4 ℃孵育過夜，TBST洗3次，每次10 min，抗鼠(1 ∶10 000)或抗兔(1 ∶5 000)二抗室溫搖床孵育1 h，TBST洗8～12次以減少背景干擾，每次5 min，ECL化學發光法顯影，拍照，以上實驗均進行3次重復后，以β-actin作為內參，ImageJ軟件進行光密度值分析。

3 結果

3.1 石榴花不同萃取部位提取物對2型糖尿病大鼠的影響

3.1.1石榴花不同萃取部位提取物對2型糖尿病大鼠體質量的影響 給藥前，正常飲食大鼠體質量顯著高于高脂飲食大鼠(P<0.01)，2型糖尿病大鼠間體質量無顯著差異(Fig 1A, B)；與給藥前相比，給藥4周后，模型組、陽性組、乙酸乙酯部位組、正丁醇部位組大鼠體質量分別降低14.16%、7.20%、8.78%、7.96%，空白組、水部位組大鼠體質量分別上升6.61%、4.67%，陽性藥Met、乙酸乙酯部位、正丁醇部位提取物能一定程度上減輕2型糖尿病導致的體質量降低，水部位組相較于模型組大鼠體質量顯著上升(P<0.05)。

3.1.2石榴花不同萃取部位提取物改善糖代謝和胰島素抵抗作用 模型組大鼠較空白組血糖顯著上升(P<0.01)，給藥前，各組2型糖尿病大鼠的血糖無顯著差異，給藥4周后，陽性組、乙酸乙酯部位組、正丁醇部位組、水部位組較模型組分別降低43.16%、11.67%、31.63%、9.77%，其中陽性組和正丁醇部位組大鼠血糖顯著降低(P<0.01)。對于采樣前1～3周的大鼠血糖水平，采用了糖化血清蛋白(GSP)評價，模型組GSP水平相比于空白組顯著上升(P<0.01)；與模型組相比，陽性組、正丁醇部位組、水部位組大鼠GSP水平顯著降低(P<0.05或P<0.01)。

2型糖尿病引起模型組大鼠血清胰島素(FINS)水平、胰島素敏感指數(ISI)相較于空白組顯著降低(P<0.05或P<0.01)；與模型組相比，各給藥組大鼠FINS、ISI顯著下降(P<0.01)。同時，與空白組相比，模型組大鼠胰島素抵抗指數(HOMA-IR)顯著上升(P<0.01)；各給藥組HOMA-IR顯著下降(P<0.01)，見Tab 1。

3.1.3石榴花不同萃取部位提取物改善2型糖尿病大鼠血脂水平 由于長期的高脂飲食，模型組大鼠的TC、TG、HDL-C水平顯著高于空白組(P<0.01)，給藥4周后，各給藥組相比于模型組血脂有不同程度的降低(Fig 1C)，二甲雙胍組、正丁醇部位組、水部位組TC水平顯著降低(P<0.05)，正丁醇部位組、水部位組TG水平顯著降低(P<0.01)，各給藥組HDL-C水平顯著降低(P<0.01)，LDL-C水平各組間無顯著差異。

3.1.4石榴花不同萃取部位提取物降低2型糖尿病大鼠氧化損傷水平 與空白組相比，模型組大鼠的GSH、MDA水平顯著上升(P<0.01)，在給藥4周后，正丁醇部位組和水部位組GSH水平較模型組顯著下降(P<0.01)，各給藥組與模型組相比MDA水平顯著下降(P<0.01)，其中正丁醇部位組降至低于空白組大鼠的MDA水平，見Fig 1D。

3.2 石榴花不同萃取部位提取物對胰島素抵抗的3T3-L1前脂肪細胞的影響

3.2.13T3-L1前脂肪細胞分化后形態變化 3T3-L1前脂肪細胞分化前呈梭形，為成纖維細胞形態(Fig 2Aa)；分化后細胞形狀變圓，體積變大，細胞核周圍有大量脂滴環繞(Fig 2Ab)，在分化結束后分化率達85%～95%；油紅O染色后的細胞細胞核周的脂滴被染成紅色(Fig 2Ac)。

Tab 1 Effects of pomegranate flower on FPG, FINS, GSP, HOMA-IR and ISI in type 2 diabetic

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vstype 2 diabetic model.

Fig 1 Effects of different extracts of pomegranate flower on type 2 diabetic A:Weight changes during administration;B:Weight of rats after four weeks of administration;C:Effects of different extracts of pomegranate flower on serum lipid in type 2 diabetic rats;D:Effects of different extracts of pomegranate flower on GSH and MDA in type 2 diabetic rats. Con: Control group. T2DM: Type 2 diabetes model group; Met: Metformin group; EtoAC: Ethyl acetate extract group; N-BAI: N-Butyl alcohol extract group; Water: Water extract group. **P<0.01 vs control group;#P<0.05 and ##P<0.01 vs T2DM.

3.2.2石榴花不同萃取部位提取物對3T3-L1脂肪細胞活力的影響 細胞分化成功后分別給予石榴花不同萃取部位提取物，給藥96 h后測定細胞活力發現：40 mg·L-1乙酸乙酯部位提取物能顯著降低3T3-L1脂肪細胞的細胞活力(P<0.05)，40 mg·L-1總提物、水部位提取物能顯著降低3T3-L1脂肪細胞的細胞活力(P<0.01)；80 mg·L-1總提物、乙酸乙酯部位提取物、水部位提取物能顯著降低3T3-L1脂肪細胞的細胞活力(P<0.01)；正丁醇部位提取物對3T3-L1脂肪細胞的細胞活力無顯著影響(P<0.05)，見Fig 2B。

3.2.3石榴花不同萃取部位提取物對胰島素抵抗的3T3-L1脂肪細胞葡萄糖消耗量的影響 用地塞米松誘導建立3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗模型后，3T3-L1脂肪細胞對葡萄糖消耗量顯著降低(P<0.01)，在給予石榴花各萃取部位不同劑量干預后，細胞葡萄糖消耗量出現不同程度的增加，羅格列酮組、乙酸乙酯部位高劑量組、正丁醇部位高劑量組、水部位高劑量組(Fig 2C)細胞葡萄糖消耗量顯著上升(P<0.01)，其中實驗組以正丁醇部位提取物高劑量組對細胞葡萄糖消耗量的提高最為明顯，與模型組相比，提高55.77%葡萄糖消耗量。總提物組細胞葡萄糖消耗量也有上升趨勢，但無統計學差異。

3.2.4石榴花不同萃取部位提取物對胰島素抵抗的3T3-L1脂肪細胞相關蛋白表達的影響 與空白組相比，模型組細胞PPARγ蛋白表達顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，羅格列酮組、水部位組細胞PPARγ蛋白表達顯著上升(P<0.01)，見Fig 2E。

各組細胞總Akt蛋白表達無顯著差異(P<0.05)，與空白組相比，模型組細胞p-Akt蛋白表達顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，羅格列酮組、正丁醇部位組、水部位組p-Akt蛋白表達顯著上升(P<0.01)；p-Akt與總Akt蛋白表達的比值趨勢與p-Akt蛋白表達一致,見Fig 2F。

Fig 2 Effects of different extracts of pomegranate flower on insulin resistant 3T3-L1 A:Morphological comparison of 3T3-L1 preadipocytes before and after differentiation(×200).a:3T3-L1 preadipocytes; b: Differentiated 3T3-L1 adipocytes; c: Differentiated 3T3-L1adipocytes stained with oil O.B:Effects of different extracts from pomegranate flowers on cell activity of 3T3-L1 group;2:Insulin resistance model; 3: Rosiglitazone group; 4: Total pomegranate flower extract group; 5: Ethyl acetate extract group; 6: N-butanol extract group; 7: Water extract group. *P<0.05,**P<0.01 vs NC group;#P<0.05 and ##P<0.01 vs IR group.

與空白組相比，模型組細胞PI3K、Glut4蛋白表達顯著下降(P<0.01)；與模型組相比，羅格列酮組、乙酸乙酯部位組、正丁醇部位組PI3K、Glut4蛋白表達顯著上升(P<0.01)，見Fig 2E。

4 討論

2型糖尿病以胰島素抵抗、胰島素相對不足為主要特征，與高脂血癥、多囊卵巢綜合癥、動脈粥樣硬化等多種疾病密切相關[8]，改善胰島素抵抗是治療2型糖尿病的關鍵。石榴花在現代醫學中的研究主要用于抗2型糖尿病，研究表明，石榴花中punicatannins A、punicatannins B兩種成分能夠抑制葡萄糖苷酶活性[9]，石榴花甲醇提取物能提高胰島素敏感性[10]。

在本研究探討了石榴花不同萃取部位的提取物的2型糖尿病大鼠和胰島素抵抗的3T3-L1脂肪細胞的影響，模型組大鼠較空白組大鼠空腹血糖升高而FINS水平降低，給藥組大鼠較模型組大鼠血糖降低而FINS水平降低，說明給藥后大鼠機體對胰島素的利用率提高，胰島素抵抗程度得到改善；對于胰島素抵抗的3T3-L1脂肪細胞，石榴花不同部位提取物能夠不同程度地提高其葡萄糖攝取量，提高PPARγ、p-Akt/Akt、PI3K、Glut4蛋白的表達。不同部位提取物對2型糖尿病的功效和機制略有不同，其中正丁醇部位提取物降糖、提高葡萄糖攝取量的作用最佳；而與其他部位提取物不同，水部位的作用機制為激活PPARγ受體，增強機體對胰島素的敏感性，并且使2型糖尿病大鼠體質量顯著上升。

PI3K/Akt信號通路與體內糖脂代謝的調節密切相關，是胰島素調節血糖平衡的關鍵途徑之一，PI3K和Akt分子表達的增強能夠啟動PI3K/Akt通路的傳導，作用于葡萄糖轉運體4(glucose transporters-4，Glut4)等多個底物受體分子，介導葡萄糖轉運入細胞，促進葡萄糖的利用。反之，若機體出現PI3K/Akt信號通路傳導障礙，則會導致機體糖脂代謝異常，引起胰島素抵抗[11]。Akt又稱為蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)，其C端調節域含有磷酸化位點Ser473，激活Akt磷酸化位點Ser473是活化Akt所必需的[12]。石榴花提取物能夠活化PI3K/Akt信號通路，改善細胞胰島素抵抗狀態。

PPARγ在成熟脂肪組織中高度表達，與脂肪細胞的分化和胰島素敏感度的調節關系密切[13]，激活PPARγ能夠促進PI3K的表達，增強機體對胰島素的敏感性，提高Glut4的表達，促進葡萄糖轉運和攝取；同時，激活PPARγ還能促進前脂肪細胞分化為成熟的脂肪細胞，引起肥胖等副作用。石榴花水部位提取物降糖的作用機制為激活PPARγ，在降糖的同時也使2型糖尿病大鼠的體質量顯著上升。

石榴花不同部位提取物對胰島素抵抗的效果和機制各有不同，其中藥效以正丁醇部位效果最佳，水部位次之，其降糖的作用機制主要為活化PI3K/Akt信號通路、激活PPARγ，改善胰島素狀態，提高胰島素敏感性，促進葡萄糖轉運，提高葡萄糖利用率。正丁醇部位提取物能夠改善胰島素抵抗而無體質量增加、肥胖的副作用，是未來石榴花降糖活性成分研究的重要方向。