用高內涵分析技術初探絨毛訶子肝毒性物質基礎

王晨曉,王志斌,馬貝貝,婁天宇,王子健

(北京中醫藥大學 1. 中藥藥理系，北京 100102， 2. 北京中醫藥研究院，北京 100029)

訶子為使君子科植物訶子(TerminaliachebulaRetz.)或絨毛訶子(TerminaliachebulaRetz. var.tomentellaKurt.)的干燥成熟果實[1]，是蒙藥、藏藥等民族藥的常用藥，在藏藥中的地位，類似于甘草在中藥中地位，其在藏藥中有“藏藥之王”的美稱。訶子藥性溫和，屬收澀藥，有澀腸止瀉、斂肺止咳、降火利咽的功效，臨床上用于治療脫肛、肺虛咳喘、咽喉腫痛，也是治療失音之要藥；現代研究對訶子的藥理學作用多有涉及，但毒性學研究卻鮮有報道。課題組前期通過動物實驗，確定絨毛訶子的肝毒性，通過小鼠急性毒性實驗得出，絨毛訶子水煎液的半數致死量(median lethal dose，LD50)LD50為18.926 g生藥·kg-1BW，絨毛訶子水煎液的LD50是70 kg人最大日用量的147.8倍。綜合分析血清生化與病理等指標，絨毛訶子的急性毒性與蓄積毒性的作用靶器官為肝臟。為了保障中藥的臨床安全用藥，迫切需要明確訶子致肝毒性的物質基礎，因此，采用一種高效、快速、靈敏度高、特異性強的體外細胞毒性檢測方法對于藥物早期篩選及上市后藥物安全性再評價都具有重要意義。

高內涵分析技術(high content screening，HCS)擁有自動定量細胞成像系統(thermo scientific toxInsight IVT平臺)，熒光試劑標記特定的靶點，優化的分析和成像方案被廣泛應用于中藥復雜的毒性成分和活性成分篩選及藥物潛在毒性篩選。利用熒光染液對相應靶點的特異性染色，用高內涵細胞成像分析平臺和藥物性肝傷分析平臺聯合考察4種單體成分對人源肝癌細胞HepG2的毒性作用，可以篩選出絨毛訶子中的單體對細胞形態、復制、周期、轉錄、翻譯、凋亡等方面的影響[2]。本實驗通過用人源肝癌細胞HepG2進行高內涵肝毒性篩選試驗，因為HepG2細胞背景清晰，表型、性狀穩定，來源于人肝胚細胞瘤，分化程度較高，其所含的生物轉化代謝酶活性穩定且與人體尋常肝細胞同根同源。肖珠[3]用HepG2細胞和人正常肝細胞L02細胞進行高內涵肝毒性的方法學考察，對其結果進行綜合統計分析，發現當HepG2細胞數量是2×105個/mL，是較合適的肝臟毒性篩選模型。

高內涵分析技術主要通過分析圖像中各個指標的熒光強度，從而檢測細胞核的形態和數目、核酸是否有損傷、DNA含量的變化、谷胱甘肽(glutathione，GSH)水平降低的變化、細胞內鈣離子的濃度、活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)含量、線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)指標等有關指標，并且根據陰性藥阿司匹林的反應值確定毒性閾值。通過比對受試藥反應值與毒性閾值的關系，確定其肝毒性風險[2-5]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞人肝癌細胞系 HepG2細胞，置于北京藥檢所藥理室實驗室細胞庫(-196 ℃)保存,購自中國細胞庫(上海)。

1.1.2藥物與試劑 沒食子酸(批號:PRF9012344)；苯甲酸(批號:PRF9112842)；莽草酸(批號:PRF9112843)；1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖(批號:PRF9101104)；噻氯吡啶(ticlopidine，批號:101296953，Sigma公司)，陰性對照阿司匹林(aspirin，批號:00209，Dr. Ehrenstorfer GmbH公司)；Ⅰ型膠原蛋白包被的96孔細胞培養板 (BD BioCoatTMPlate Product N0.354407，批號34217010)；DMEM(dulbecco′s modified eagle media)培養基(批號:1719980，Gibco公司)；標準胎牛血清(批號:1739464，Gibco公司)；青鏈霉素(批號:1780186，Gibco公司)；胰蛋白酶(批號:1742078，Amresco公司)；DMSO(批號:19947100813，默克股份有限公司)； PBS緩沖液(批號：20190629)；0.4%臺盼藍溶液(批號:1189952，Invitrogen公司)；95%乙醇試劑(山東利爾康醫療科技股份有限公司)。MitoTrackerTMOrange CMTMRos-Special Packaging Reduced rosamine MitoTraacher probes(批號：1985376)；CellROXTMGreen Reagent，for oxidative stress detection(批號：2018177)；Hoechst 33342 Trihydrochloride(批號：2048155)；Thiol-Reactive Probes Reactive dye(lyophilized solids)(批號：211582)。

1.1.3主要儀器 Thermso Scientific Cellomics，(美國)；NSF-1389-A2生物安全柜；Olympus 1 X71生物顯微鏡；Thermo 311 CO2培養箱；Invitrogen全自動細胞計數儀；SN510C立式壓力蒸汽滅菌器。

1.1.4對照品溶液及工作曲線的制備 在無菌環境中配制，根據Thermo Scientific Toxlnsight Drug Induced Liver Injury Assay 的指導手冊中推薦的對照品加樣濃度，陰性對照阿司匹林的最大血藥濃度(Cmax)為0.995 mg·L-1，陽性對照品噻氯吡啶的Cmax為2.13 mg·L-1，用不含血清的DMEM培養基將對照品配成200、100、50、25、12.5、6.25、3.12、1.56Cmax共8個濃度。

1.1.5供試品的配制 取沒食子酸(t1)，苯甲酸(t2)，莽草酸(t3)，1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖(t4)，在無菌EP管內，用不含血清的DMEM培養基配制成500、125、62.5、31.25、15.62、7.81、3.91 mg·L-1共8個濃度的待測物溶液。

1.2 方法

1.2.1HepG2細胞的復蘇與傳代培養 將儲存在實驗室細胞庫(-196 ℃)的HepG2細胞，迅速取出，放入提前保溫的37 ℃水浴鍋中，注意水位線，避免液面污染。將融化的細胞凍存液將其移入15 mL滅菌離心管中，加入37 ℃ 10 mL的DMEM完全培養基(15%的胎牛血清 (FBS，V/V)，100 U·mL-1的青鏈霉素)，700 r·min-1離心9 min，吸出上清，加入5 mL完全培養基，吹打均勻，接種于細胞培養瓶中。細胞每隔3 d進行一次1 ∶3的傳代，傳代時，棄掉原培養液，再用PBS緩沖溶液沖洗2次后，加入0.25%胰酶2 mL消化約30 s，棄去胰酶，放入培養箱中繼續消化約3 min，觀察細胞是否脫離培養瓶壁，之后加入2～3 mL的DMEM完全培養基進行吹打，在倒置顯微鏡下觀察細胞相互分散，吹打均勻。再將細胞混懸液分裝至若干個細胞培養瓶中，加入5～8 mL的DMEM完全培養基，輕輕吹打均勻，在37 ℃，5% CO2的培養箱中培養。

1.2.2細胞鋪板與加樣 在倒置顯微鏡下觀察，將處于對數增長期的HepG2細胞，棄去原培養液，用PBS洗2～3次，吸取殘留的PBS，加入0.25%胰酶2 mL消化30 s，棄去胰酶，放在37 ℃，5% CO2的環境中繼續讓胰酶反應約3 min。加入2～3 mL的DMEM完全培養基進行吹打，使細胞均勻分散開。取吹打均勻的10 μL細胞混懸液，加入10 μL 0.4%臺盼藍溶液混勻，取混合均勻的混合液10 μL加入到計數板中，經全自動細胞計數儀計數后。用DMEM細胞培養基調整細胞濃度為2×105個/mL,以100 μL/孔接種到I型膠原蛋白包被的96孔板中，在37 ℃，5% CO2條件下培養24 h。24 h后，將I型膠原蛋白包被的96孔板棄去原培養液，每孔分別加入含有不同濃度的不同藥物(沒食子酸，苯甲酸，莽草酸，1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖)。橫向設置3個平行孔為同一濃度，每個藥物的最大濃度為500 mg·L-1，依次倍比稀釋，最低給藥濃度為3.91 mg·L-1。實驗設置陰性對照阿司匹林、陽性對照噻氯吡啶和溶媒對照，設置8個濃度。加樣結束后，將96孔板在37 ℃，5% CO2條件下，培養24 h。

1.2.3染色 按試劑盒說明書的要求，藥物加入細胞24 h后，取出I型膠原蛋白包被的96孔板，棄去原藥液，之后將避光放置的染液，以100 μL/孔避光加入到培養板內，37 ℃條件下孵育45 min。45 min后，將I型膠原蛋白包被的96孔板內染液小心吸去(不要接觸板孔內壁)，再加入放置室溫的PBS緩沖溶液，吸出，最后每孔中加入100 μL PBS，即可上機檢測。

1.2.4ToxInsight IVT平臺成像與分析與預測 在ToxInsight IVT平臺上自動獲取熒光標記的細胞的圖像，以檢測不同的熒光標記的細胞靶點，然后通過Cellomics Compartmental Analysis BioApplication進行存儲和自動分析。采用ToxInsight IVT平臺的采集圖像。

第一通道通過測量圖像中的細胞數量來計算細胞密度和細胞損失。通過用DNA染色測量每個細胞核區域中DNA探針(Hoechst 33342)的總整合熒光強度來監測核DNA含量。第二通道GSH水平的降低是通過利用細胞可滲透的還原型熒光谷胱甘肽指示劑對細胞質區域中的總熒光強度進行積分測定。第三通道通過對每個細胞核區域中由熒光ROS染料染色產生的總熒光強度進行積分，可以對ROS水平進行定量。 第四通道用對線粒體膜電位變化敏感的探針，并通過測量該探針在核和細胞質區域之間的積分熒光強度差異，檢測MMP變化。

對采集的圖像進行分析，將獲得的定量多參數細胞靶數據導入到ToxInsight DILI檢測分析模板，以確定目標化合物是否具有肝毒性，并根據其多參數反應的強度對其進行排名，通過檢測樣品對結構和功能完整細胞的生長、凋亡、形態及代謝的影響，從而確定化合物的潛在毒性及相關藥物的生物活性[5]。

2 結果

2.1 陰性對照閾值的確定如Fig 1和Fig 2所示，陽性藥噻氯吡啶5個指標檢測結果均為陽性，隨著濃度的一系列變化，5個指標都超出其安全閾值范圍。結果表明陽性藥噻氯吡啶對HepG2細胞增殖有抑制作用，具有明顯的肝毒性風險。如Fig 1所示，陰性藥阿司匹林隨著濃度變化，5個指標檢測結果均為陰性。表明阿司匹林對HepG2細胞在細胞數目、DNA含量、GSH降低水平、ROS含量及MMP改變5個指標均在安全閾值范圍內，阿司匹林對HepG2細胞無毒性作用，無肝毒性風險。這兩個藥物的結果與其前期文獻報道相一致，因此表明本實驗所采用的方法及操作準確。

2.2 樣品高內涵分析結果如Fig 3所示，沒食子酸有4個指標檢測結果為陽性，在Fig 4中，① 第一通道細胞核內的熒光數目反映了HepG2細胞數目的變化，細胞數目只有下限閾值。② 第一通道細胞核內的熒光強度反映了HepG2細胞核中DNA含量的變化，沒食子酸和噻氯吡啶與陰性對照阿司匹林相比，數量有明顯差異，細胞數量減少，細胞出現皺縮，發生細胞凋亡。③ 第二通道細胞質中的熒光強度反映了GSH降低水平, 1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖與陰性對照阿司匹林相比，可以看到熒光強度減弱，GSH含量降低明顯。④ 第三通道細胞中的熒光強度反映了ROS含量的變化，ROS只有上限閾值，沒食子酸的第三通道熒光強度與阿司匹林相比，明顯變弱。⑤ 第四通道細胞質與細胞核中的熒光強度的差值反映了線粒體膜電位的變化[6]。

Fig 1 Results of liver toxicity analysis of aspirin and ticlopidine(n=3)

2.2.1沒食子酸高內涵分析結果 如Fig 5和Fig 6所示，沒食子酸在30 mg·L-1的給藥濃度下，DNA含量和細胞數量在安全閾值范圍內，當給藥濃度超過30 mg·L-1時，DNA含量下降，細胞出現凋亡，數量明顯減少，當濃度達到30 mg·L-1時，細胞數量減少至安全閾值以下。當沒食子酸的給藥濃度62.5 mg·L-1以上，對GSH降低水平、ROS含量的影響較大，偏離其安全閾值。如Fig 7和Fig 8所示。

Fig 2 Influence of aspirin and ticlopidine on cell number, DNA number, GSH levels, ROS content, and MMP of HepG2 cells(n=3)

Fig 3 Sample high-content hepatotoxicity risk assessment(n=3)

2.2.2苯甲酸高內涵分析結果 苯甲酸隨著給藥濃度的增加，對HepG2細胞在細胞數目、DNA含量和MMP變化等指標上，均未超出安全閾值范圍，隨著給藥劑量濃度增加到100 mg·L-1時， GSH降低水平觸及閾值，隨著劑量增加，GSH含量保持平穩接近下限閾值。隨著劑量增加至500 mg·L-1，ROS呈現上升趨勢，超出其安全閾值。

Fig 4 Representative images of drugs obtained at different wave length by HCS assay(×20)

Fig 5 Dose-effect curve of different concentrations of shikimic acid(t1), benzoic acid(t2),gallic acid(t3), 1,2,3,4,6-o-pentagalloglucose(t4) on number of cells(n=3)

Fig 6 Dose-effect curve of different concentrations of shikimic acid(t1), benzoic acid(t2), gallic acid(t3), 1,2,3,4,6-o-pentagalloglucose(t4)on DNA content(n=3)

Fig 7 Dose-effect curve of different concentrations of shikimic acid(t1), benzoic acid(t2), gallic acid(t3), 1,2,3,4,6-o-pentagalloglucose(t4)on GSH level(n=3)

2.2.31,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖高內涵分析結果 1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖在10 mg·L-1的給藥濃度下，細胞數量呈上升趨勢，隨著給藥濃度增加，DNA含量急劇變化，對細胞數量影響較大，細胞呈快速下降趨勢。1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖在10～500 mg·L-1的給藥濃度下，隨著劑量增加，DNA含量、GSH含量和ROS含量如Fig 6、Fig 7和Fig 8所示，成折線變化。

2.2.4莽草酸高內涵分析結果 在一系列濃度的變化下，莽草酸在MMP變化、細胞數目、DNA含量、GSH降低水平和ROS含量均呈陰性，表明對HepG2細胞無毒性作用，如Fig 5～9所示。

Fig 8 Dose-effect curve of different concentrations of shikimic acid(t1), benzoic acid(t2), gallic acid(t3), 1,2,3,4,6-o-pentagalloglucose(t4) on ROS content(n=3)

Fig 9 Dose-effect curve of different concentrations of shikimic acid(t1), benzoic acid(t2), gallic acid(t3), 1,2,3,4, 6-o-pentagalloglucose(t4) on MMP(n=3)

3 討論

通過高內涵篩選技術分析絨毛訶子中單體成分對HepG2細胞的毒性作用，結果顯示，沒食子酸致肝毒風險最高，而后由高到低依次為1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖、苯甲酸、莽草酸，莽草酸顯示無肝毒性風險。沒食子酸的MMP指標呈現陰性結果，其他指標都偏離安全閾值呈現陽性結果，且其肝毒性風險超過了陽性對照藥物噻氯吡啶。鞣質作為一類結構復雜的多元酚類化合物，可對肝臟造成嚴重的毒性損害，而訶子中鞣質的含量約為32%～34%，由此推測歸于鞣質的沒食子酸是絨毛訶子致肝毒的主要成分。實驗結果表明30 mg·L-1為沒食子酸致肝損傷的臨界濃度，在30 mg·L-1的濃度以下無致肝毒風險。通過HCS分析結果可得，給藥濃度在10 mg·L-1以下，各單體的各個指標的量效曲線都在安全閾值內。

當沒食子酸的給藥濃度達到100 mg·L-1時，其GSH含量成折線急劇變化，GSH是由甘氨酸、谷氨酸以及半胱氨酸組成的三肽類化合物，發揮抗氧化和解毒的作用，在應激狀態下保護肝臟避免氧化損害，隨著GSH含量的變化，ROS含量也隨著變化，當ROS過量時，易攻擊線粒體，當線粒體受損時，引發ROS過量生成，造成惡性循環[7,8]。

查閱相關文獻及古籍，絨毛訶子并無毒性記載。在實驗過程中，課題組發現訶子的毒性，并對其毒性靶器官及毒性特點進行進一步研究。通過用HCS分析技術來預測受試物的肝毒性已經非常成熟，無論是成分復雜，多靶點多效應的中藥注射液還是新藥的研發階段，HCS分析技術用于不僅可以預測其受試物的肝毒性，還可以闡明與多個指標(細胞數目，DNA含量，降低GSH水平，誘導ROS過度產生及改變MMP)之間的聯系，從而確定化合物的潛在毒性及相關藥物的生物活性，可用于大規模藥物篩選[8-10]。

(致謝:本實驗在北京市藥品檢驗所藥理毒理科室實驗室完成，感謝藥理毒理室各位老師和同學對實驗的指導和幫助)