新鮮冷凍和福爾馬林固定石蠟包埋胃黏液腺癌組織中miRNA表達譜的比較

張夢嵐，賀菊香，潘 莉，鞏 雪，王豐梅

我國胃癌的病死率位居全部惡性腫瘤的第2位[1]。自1993年miRNA被首次報道以來[2]，miRNA與腫瘤的研究取得了較大的進展。在胃癌中的研究顯示，miRNA在胃癌的增殖、遷移和侵襲中發揮重要作用，而且參與了腫瘤的發生、發展，并與腫瘤的療效、臨床病理特征及預后等關系十分密切[3-4]，所以miRNA很有可能成為胃癌早期篩查、預后判斷及療效評估的標志和靶點。但由于樣本保存方法、病理類型、研究方法或樣本來源地域差異等各種原因，導致胃癌組織中miRNA的研究結論不完全一致，甚至出現互相矛盾的結果[5-7]。因此，本實驗用miRNA芯片技術對新鮮冷凍和福爾馬林固定石蠟包埋配對的同一組織學類型的胃黏液腺癌組織中miRNA的表達譜，進行了篩查對比和統計分析，以初步探討不同方法保存的同一胃癌組織類型中miRNA的表達普是否存在差異。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗標本來自2017年在青海省人民醫院手術的胃癌患者，合計6例。新鮮冷凍組織由手術醫師在手術過程中切取，并將所取組織塊分為2份，一份迅速放入液氮罐中冷凍，后期轉至-80 ℃超低溫冰箱保存。一份由福爾馬林固定石蠟包埋以便后期病理學核實是否切取到腫瘤及腫瘤組織所占整塊組織的比例(腫瘤組織占比)。福爾馬林固定石蠟包埋組織是經10%中性福爾馬林固定，由病理醫師取材后石蠟包埋而成的常規蠟塊。所取組織塊的質量均約為100 mg。術中所取的新鮮組織和福爾馬林固定石蠟包埋組織經切片、染色后，由臨床病理醫師進行復診，挑選癌組織占比均在50%以上，胃癌組織學類型均為胃黏液腺癌，并且患者術前未行任何放、化療的6對配對樣本進行芯片檢測實驗，并采集臨床病理資料。6例樣本的基本信息、病理特征及腫瘤組織在取材組織塊中所占的比例情況見表1。

1.2 LC Sciences 芯片雜交實驗基本過程 提取新鮮冷凍和石蠟包埋組織樣本的總RNA，用Agilent 2100 bioanalyzer進行RNA數量和質量的測定，質檢合格后樣本進行芯片微陣列雜交實驗。

微陣列實驗由LC Sciences公司進行。微陣列實驗使用5 μg總RNA樣本。使用Poly(A)聚合酶在總RNA 3′端加上Poly(A)尾巴，再將一個寡聚核苷酸標記與該Poly(A)尾巴連接用于后續的熒光標記。雜交反應利用微循環泵在μParaflo微流體芯片上過夜進行。雜交使用含有25%甲酰胺的100 μL 6×SSPE緩沖液，雜交溫度為34 ℃。RNA與探針雜交后，與標記特異結合的Cy3染料在微流體芯片上循環流動進行染色。利用激光掃描儀(GenePix 4000B，Molecular Device)采集雜交圖像并使用Array-Pro圖像分析軟件(Media Cybernetics)進行圖像數字化轉換。數據分析首先是減除背景值，然后使用LOWESS過濾后進行信號歸一化。總RNA的提取，質量檢測，芯片雜交及結果分析均由杭州聯川生物公司完成。

表1 6例樣本的基本信息、臨床病理特征及腫瘤組織的占比

1.3 數據處理 激光掃描儀采集芯片雜交圖像后進行圖像數字化轉換，然后原始數據進行背景值減除，轉化為以2為底的對數(log2)，利用Transcriptome AnalysisConsole(美國Affymetrix公司)軟件進行差異分析檢出兩組樣本差異表達的miRNA，然后采用t檢驗的統計學方法對差異表達的miRNA進行差異顯著性檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。并對新鮮冷凍和石蠟包埋樣本的miRNA表達譜進行Pearson相關性及主成分分析(principal component analysis，PCA)分析，評估配對樣本間miRNA表達譜的相關性及樣本聚類情況。

2 結果

2.1 新鮮冷凍與福爾馬林固定石蠟包埋胃癌樣本中提取總RNA的質量及含量檢測 兩組樣本提取總RNA后經Agilent 2100 bioanalyzer檢測發現，術中取材后立即投入液氮后轉至-80 ℃超低溫冰箱保存的新鮮冷凍樣本中提取的總RNA質量較高，6個樣本均有不同峰值的28 S和18 S波峰，完整度符合28 S是18 S的1～2倍范圍要求(圖1)。福爾馬林固定石蠟包埋樣本中提取的總RNA有相對比較明顯的降解，在6個樣本中28 S和18 S的波峰均不明顯(圖2)。提取的樣本RNA雖有部分降解，但在miRNA近25 nt處波峰明顯，說明兩組標本中的miRNA保存度完整，達到miRNA芯片雜交要求，可以進行下游實驗。

2.2 芯片檢測配對新鮮冷凍和福爾馬林固定石蠟包埋胃癌組織中的miRNA表達譜 芯片雜交完成后，進行圖像掃描，轉換成數據并進行背景及歸一化處理后數據經過統計學t檢驗，發現新鮮冷凍組織和福爾馬林固定石蠟包埋兩組樣本中miRNA的表達譜差異有顯著性，如果以P<0.05為檢驗水準則兩組差異表達的miRNA有114個(圖3)。如果P<0.01為檢驗水準，則兩組有顯著差異表達的miRNA有16個(圖4)。

圖1 新鮮冷凍標本中提取的總RNA質量檢測結果：A～F.樣本1～6的新鮮冷凍標本，縱坐標FU為熒光值，橫坐標nt為核苷酸數

圖2 福爾馬林固定石蠟包埋樣本中提取的總RNA質量檢測結果：A～F.樣本1～6的福爾馬林固定石蠟包埋標本，縱坐標FU為熒光值，橫坐標nt為核苷酸數

圖3 新鮮冷凍和福爾馬林固定石蠟包埋樣本中差異表達的miRNA聚類圖(P<0.05)

圖4 新鮮冷凍和福爾馬林固定石蠟包埋樣本中差異表達的miRNA聚類圖(P<0.01)

2.3 miRNA芯片雜交數據統計結果按差異倍數再篩選 miRNA芯片雜交數據統計結果在篩選差異表達的miRNA時除了考慮統計學的檢驗水準P值以外，另一重要的因素就是Fold Chang即差異倍數，比較組和對照組基因表達量平均值的差異倍數越大，說明差異越顯著。常規標準是Fold Change (log2)≥1或Fold Change(log2)≤-1。為了顯示兩組間差異更顯著的miRNA，常用的標準是Fold Change的絕對值≥2。本實驗結果以Fold Change的絕對值≥2進行再次篩選，結果兩組間分別有76個(P<0.05)和14個(P<0.01)miRNA呈顯著差異表達。

2.4 檢測樣本miRNA表達譜的PCA PCA分析結果所示(圖5)，主成分1(PC1)、主成分2(PC2)的累積貢獻率達90%。從圖中看出miRNA表達譜因樣本是新鮮冷凍或石蠟包埋的類型不同而有所差異，并且6例福爾馬林固定石蠟包埋樣本比新鮮冷凍樣本miRNA的表達譜聚類更好，即新鮮冷凍組的離散度比福爾馬林固定石蠟包埋組大，尤其是新鮮冷凍組的4號和6號樣本的離散度較大。

2.5 Pearson檢驗 為測定配對新鮮冷凍和福爾馬林固定石蠟包埋胃癌樣本基因表達譜的一致性，進行了Pearson相關性檢驗(圖6)。配對的新鮮冷凍和福爾馬林固定石蠟包埋樣本中樣本1、2、3、4、5對之間呈極強相關關系(相關系數樣本1為0.95，樣本2為0.97，樣本3為0.99，樣本4為0.97，樣本5為0.81)，樣本6為強相關關系(相關系數為0.69)。

圖5 樣本miRNA表達譜的PCA分析

圖6 Pearson相關性檢驗圖

3 討論

研究發現絕大多數腫瘤均存在miRNA表達失調，這些異常表達的miRNA可參與腫瘤的發生、分化、增殖、侵襲、轉移、血管生成和免疫反應等。miRNA的研究實驗應使用含高質量RNA的新鮮冷凍樣本。然而，新鮮冷凍組織的取材、保存和運輸工作均比較困難，而福爾馬林固定石蠟包埋的樣本不僅有大量的病理資料，且保存時間較長，應該是人類研究疾病的寶貴資源庫，尤其是在回顧性研究和少見疾病的研究中可以發揮重要作用。所以，許多研究者想利用這類大量儲存在醫院組織庫中且帶有詳細的臨床資料的福爾馬林固定石蠟包埋組織作為樣本，并有研究認為在miRNA實驗中，因miRNA跟長鏈RNA或DNA相反，因長度較短(19～25 nt)，成熟miRNA的降解似乎不受福爾馬林固定的影響[8]，因此福爾馬林固定石蠟包埋樣本適用于miRNA的表達研究[9-10]。也有多篇文獻報道了福爾馬林固定石蠟包埋標本在腎、前列腺、乳腺等不同組織中研究miRNA表達的可行性[11]。另有學者認為福爾馬林固定石蠟包埋樣本在制備和儲存過程不可避免地會降解RNA[12]，導致RNA碎裂，所以福爾馬林固定石蠟包埋組織中核酸不適合用于基因表達譜的實驗[13]。

為此，本實驗在美國Affymatrix公司全基因組表達譜芯片上用配對的6例新鮮冷凍和6例福爾馬林固定石蠟包埋的胃黏液腺癌樣本進行miRNA的芯片雜交和數據的統計篩選后發現Fold Change的絕對值≥2為標準，結果兩組間有顯著差異表達的miRNA分別有76個(P<0.05)和14個(P<0.01)。該結果提示配對的新鮮冷凍和石蠟包埋的同一組織學類型的胃癌組織miRNA表達譜存在差異性，即新鮮冷凍組織樣本中miRNA基因的表達量不能準確轉化為福爾馬林固定石蠟包埋樣本中的表達量，因此，如果研究直接利用福爾馬林固定石蠟包埋樣本中miRNA基因的絕對表達值，可能得到的結果不太準確，文獻指出得到更多的可能是與降解相關的信息[14]。

從本組miRNA表達譜的相關性分析看出，配對標本新鮮冷凍與福爾馬林固定石蠟包埋樣本呈高度相關(r值均大于0.65)，配對樣本6相關性相對較低，可能與樣本6新鮮冷凍(腫瘤組織占65%)與福爾馬林固定石蠟包埋樣本(腫瘤組織占100%)中的腫瘤細胞占比差異較大有關。聚類分析顯示，新鮮冷凍組的4號和6號樣本的離散度較大，在樣本原始病理資料中顯示這2例樣本中腫瘤組織的占比較低，而聚類很好的福爾馬林固定石蠟包埋樣本由病理醫師在診斷取材過程中獲得，比在手術過程中的取材更準確，腫瘤組織占比更高，所以推測新鮮冷凍標本的離散度較大與腫瘤組織的占比較低有關。所以在腫瘤組織核酸表達的研究中組織在鏡下的形態學檢查十分重要，樣本中所含的腫瘤壞死區、淋巴細胞浸潤程度或非腫瘤細胞占比等均可能會影響實驗數據的正確性。該結論亦被de Biase等[11]的研究證實。Gao等[15]的實驗亦分析出很多miRNA與研究結論不一致，原因之一可能是標本收集標準的差異。

以上結果提示如果取材準確，福爾馬林固定石蠟包埋樣本和新鮮冷凍樣本之間的miRNA表達譜高度相關，即福爾馬林固定石蠟包埋樣本同樣可用于基因表達分析。所以有文獻進一步指出兩組樣本內絕大部分基因間表達水平的相對大小關系不受降解的影響[16]，因此可以利用福爾馬林固定石蠟包埋樣本用于基因表達高低相對關系的研究。本組實驗結果顯示，新鮮冷凍樣本和福爾馬林固定石蠟包埋樣本中miRNA的表達雖然有很高的相關性，但兩者miRNA的表達譜中有114個(P<0.05)和16個(P<0.01)存在顯著差異。同時，另指出在配對的肺腺癌、浸潤性乳腺癌和結腸癌中，福爾馬林固定石蠟包埋樣本與新鮮冷凍樣本相比，其上千基因的表達檢測值均至少有2倍的改變[16]。在扁桃體腫瘤中的研究中比較了新鮮冷凍標本和福爾馬林固定石蠟包埋標本的miRNA表達譜，雖然兩組之間表達的miRNA相關性較好，但差異表達的miRNA重疊程度亦不理想[17]。所以利用福爾馬林固定石蠟包埋組織也不太適合用于全部核酸相對表達量的研究，推測可能不同miRNA穩定性有差異，有些更易被降解或轉化。

總之，本組實驗結果提示，在腫瘤核酸表達的研究中，對取材樣本在鏡下核實腫瘤組織的占比非常重要；而且配對的福爾馬林固定石蠟包埋和新鮮冷凍組織中miRNA的表達存在顯著差異，如果在研究中用相對容易獲得且病理資料完整的福爾馬林固定石蠟包埋組織作為研究材料，那么可能會由于甲醛固定處理過的石蠟包埋塊標本經歷了長時間的保存，miRNA可能發生了核酸與蛋白質交聯反應，單甲基化基團的修飾等過程，導致miRNA發生降解或轉化，所以采用福爾馬林固定石蠟包埋組織中miRNA基因的絕對表達值，結論可能不太準確，可能會導致某些miRNA的丟失從而影響早期胃癌篩查的關鍵性分子標志物miRNA的檢出及下游逆轉錄和基因表達定量分析。本實驗及其他報道均顯示新鮮冷凍與福爾馬林固定石蠟包埋組織miRNA的表達譜呈高度的相關性，但用福爾馬林固定石蠟包埋組織作為研究材料能否反映全部miRNA基因的相對表達仍需要進一步的實驗去證實。