清熱化濕方對MNU 聯合幽門螺桿菌感染小鼠胃組織中TNF-α、IL-8及TLR-4 水平的影響

鐘 嬋，張 濤，黃李冰雪，劉 暢，孫艷珍，黃曉燕，陳遠能?

（1.廣西中醫藥大學，廣西 南寧530000； 2.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院消化內科，廣西 南寧530000；3.廣西醫科大學第一附屬醫院，廣西 南寧530000）

胃癌仍然是全球癌癥死亡的主要原因之一，屬亞洲地區分布最廣［1］。胃癌的病理發生機制頗為復雜，受多因素、多基因的影響，而幽門螺桿菌已被公認為致癌的關鍵因子［2］，近幾年已被成為研究防治胃癌的重要靶點。非可控性炎癥使胃黏膜發生癌變成為必然趨勢，因此探討幽門螺桿菌感染相關胃癌中炎癥介質、腫瘤壞死因子的表達情況尤為重要。以中醫藥理論指導為基礎，前期課題組臨床研究觀察清熱化濕方能減輕炎癥反應，明顯緩解幽門螺桿菌感染相關胃癌的作用反應。為進一步觀察其防治胃癌的可能機制，課題組開展清熱化濕方對幽門螺桿菌相關胃癌中TNF-α、IL-8 及TLR-4 表達研究。

1 材料

1.1 動物及菌株 SPF 級雄性BALB／c 小鼠90 只，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號SCXK （湘）2001-0003，合格證號0060892，實驗單位使用許可證編號SCXK （桂） 2010-0001。幽門螺桿菌悉尼菌株SS1 系南昌大學第一附屬醫院消化疾病重點實驗室惠贈。大鼠組織取材于廣西中醫藥大學實驗動物中心實驗室。

1.2 儀器與試劑 哥倫比亞血瓊脂基礎（批號CM911）、無菌脫纖維綿羊血（北京索萊寶科技有限公司）；N-甲基-N-亞硝基脲 （MNU，美國Sigma 公司，批號N136701）；Anti-TLR4 antibody （批號AB13556）、Anti-TNF-α antibody（批號AB6671），均購自英國Abcam 公司；IL-8 antibody（批號38419，美國Sab 公司）；RM2135 切片機（德國徠卡公司）；倒置光學顯微鏡（日本Olympus 公司）；離心機、BCA 蛋白定量試劑盒（北京華肽先鋒生物科技有限公司）。

1.3 藥物 清熱化濕方（藿香6 g，川厚樸3 g，姜半夏4.5 g，赤茯苓9 g，杏仁9 g，生薏 苡仁12 g，白豆蔻1.8 g，豬茯苓4.5 g，淡豆豉9 g，澤瀉4.5 g，黃連12 g，梔子12 g） 購自廣西中醫藥大學第一附屬醫院仁愛分院。上述藥材用蒸餾水煎成藥液，濃縮，配制成1 g 生藥／1 mL藥液，過濾分裝4 ℃冰箱保存。蘭索拉唑腸溶膠囊（批號H20065186，揚子江藥業集團有限公司，15 mg）；阿莫西林膠囊 （批 號 H44021351，珠海聯 邦制藥 有限公 司，250 mg）；克拉霉素（批號H20031041，江蘇恒瑞醫藥有限公司，500 mg）。

2 方法

2.1 幽門螺桿菌培養 將幽門螺桿菌悉尼菌株SS1 系復蘇后，接種于7%瓊脂羊血培養基中，37 ℃細菌培養箱，在厭氧條件下培養48 h，可見菌落長出，將菌落刮下溶于布氏肉湯，制成幽門螺桿菌菌液，紫外分光光度計測濃度，幽門螺桿菌菌液為109CFU／mL。經快速尿素酶試驗證實幽門螺桿菌培養成功。

2.2 模型制備 參照文獻［3］ 將適應性喂養1 周的90 只健康BALB／c 小鼠，隨機分成6 組，正常組、模型組、清熱化濕方組（低、中、高劑量）、陽性對照組（抗幽門螺桿菌三聯藥）。除正常組外，剩余各組均予小鼠幽門螺桿菌菌液0.8 mL 灌胃，隔天1 次，共5 次。待幽門螺桿菌定植成功后開始進行分組干預，不同劑量清熱化濕方組的小鼠分別按低、中、高（2.71、5.43、10.86 g／kg） 劑量灌胃，1 d／次，持續28 周；陽性對照組（蘭索拉唑腸溶膠囊+克拉霉素+阿莫西林） 的小鼠按成人用藥的6 倍給藥灌胃。同時予干預組小鼠MNU 懸液 ［MNU-水 （5 mg ∶3 mL）］ 0.3 mL 灌胃，每周1 次，持續10 周；并注意觀察各小鼠一般情況。末次給藥后處死全部小鼠，沿胃小彎縱軸將胃組織分為兩半，一半做快速尿素酶試驗，另一半置于10%中性甲醛、電鏡固定液中備測。

2.3 小鼠胃組織形態學改變及超微結構變化 常規HE 染色，光鏡下觀察炎癥和癌變情況；使用醋酸鈾染色，透射電鏡下觀察小鼠胃黏膜超微結構變化。

2.4 RT-PCR 檢測胃黏膜IL-8、TLR-4 及TNF-αmRNA 表達 以β-actin為內參，檢測胃黏膜IL-8、TLR-4 及TNF-αmRNA 表達，采用TRIzol 法提取RNA，然后取2 μg RNA進行逆轉錄得到cDNA，將逆轉錄的cDNA 稀釋10 倍，作為模板進行PCR 檢測。反應條件為95 ℃120 s～95 ℃5 s～60 ℃30 s，35～40 循環。以目的基因與內參的mRNA 表達比值作為目的基因的相對表達量。

表1 引物序列

2.5 Western blot 檢測胃黏膜IL-8、TLR-4 及TNF-α 蛋白表達 以GADPH 抗體為內參，檢測胃黏膜IL-8、TLR-4 及TNF-α 蛋白表達，采用凝膠成像系統掃描，以特異性條帶濃度與面積的乘積為有效值，反映蛋白表達水平。具體步驟為蛋白制備，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜、封閉、抗原抗體反應，顯色、檢測分析。

2.6 統計方法 用SPSS 24.0 軟件進行統計學分析，計量資料用（） 表示，符合正態分布，采用方差分析；等級資料采用秩和檢驗。以P≤0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 小鼠一般情況 造模第13 周開始，模型組部分小鼠出現精神差、食欲不振、毛發脫落、慵懶嗜睡等現象，有4 只小鼠死亡；正常組小鼠一般情況尚可；清熱化濕方組、陽性對照組中各有2 只小鼠死亡。經解剖發現，模型組部分死亡的小鼠腹腔臟器有穿孔、粘連、局部黑變等現象。

3.2 光鏡下各組小鼠胃黏膜組織病理學變化 圖1 可見光鏡下正常組無改變；小鼠胃癌造模成功率約70%，模型組癌變率占66.67%，模型組符合中分化腺癌改變；藥物干預后，清熱化濕方組散在潰瘍改變，未見異型細胞。陽性對照組炎性細胞浸潤，符合潰瘍改變，可見少許異型細胞。

3.3 吉姆薩染色檢測各組小鼠幽門螺桿菌感染情況 圖2可見正常組無幽門螺桿菌感染；模型組、陽性對照組、清熱化濕方組胃黏膜細胞核呈藍色或紫色，胞漿呈粉紅色，幽門螺桿菌呈平滑的淡藍色至藍色，彎曲狀或弧形，菌體清楚，主要分布在胃黏膜及胃小凹表面，呈單個散在、片灶狀或成團聚集，組織背景清晰，胃黏膜病變易見。提示模型組、陽性對照組、清熱化濕方組幽門螺桿菌定植成功。

3.4 各組電鏡下小鼠胃黏膜超微結構變化 圖3 可知正常組無明顯改變；模型組細胞間隙連接結構嚴重破壞，癌細胞散在于間質中；清熱化濕組細胞間隙連接結構破壞，分化較差的上皮細胞和腸化生細胞核質比大于1，見少許凋亡小體。陽性對照組細胞間隙連接結構破壞，分化較差，見少許凋亡小體。

圖1 光鏡下各組小鼠胃黏膜組織病理學變化

圖2 吉姆薩染色檢測各組小鼠幽門螺桿菌感染情況（×40）

3.5 各組小鼠胃黏膜IL-8、TLR-4、TNF-α 蛋白表達 與正常組比較，模型組IL-8、TLR-4、TNF-α 表達上升，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，清熱化濕方組IL-8、TLR-4、TNF-α 表達下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。

3.6 各組小 鼠胃黏 膜IL-8、TLR-4、TNF-α mRNA 表達 與正常組比較，模型組IL-8、TLR-4、TNF-α 表達上升，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，清熱化濕方組IL-8、TLR-4、TNF-α 表達下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖5。

4 討論

以中醫理念探討胃癌病機，祖國醫學認為，飲食不節，情志失調，脾胃受損，運化升降失常，使氣結痰凝，瘀停熱蘊，氣、痰、瘀、毒互結胃腑而成。中醫胃癌治則始終以保護脾胃正氣，推動其運化生氣血，條達升降之職。課題組以清熱化濕、健脾和胃的治則，選擇清熱化濕方探討該方防治胃癌的相關機制；方中淡豆豉、藿香芳香透表濕，開郁陽氣；藿香、白蔻仁、厚樸芳香化濕，佐半夏行運脾化濕之功；杏仁開泄肺氣于上焦，肺氣宣降，水道自調，而治濕宜利小便，水道通調，則濕有去路，故茯苓、豬苓、澤瀉、薏苡仁相伍通滲下焦。黃連擅清中焦濕熱之邪，梔子清三焦之火。諸藥合用，宣化表里濕熱，通調上、中、下三焦，奏清熱化濕、健脾和胃功效［4-7］。

圖3 各組小鼠電鏡下胃黏膜超微結構變化（×12 000）

圖4 各組小鼠胃黏膜IL-8、TLR-4、TNF-α 蛋白表達

圖5 各組小鼠胃黏膜IL-8、 TLR-4、 TNF-α mRNA 表達

研究報道，幽門螺桿菌感染參與了胃癌的演變過程［8］，幽門螺桿菌可刺激胃上皮細胞產生炎癥因子，如IL-8、TNF-α 等，而幽門螺桿菌要啟動炎癥因子必須借助TLR-4 受體，該受體參與識別細菌細胞壁中的脂多糖（LPS），幾乎所有的TLRs 都能激活MyD88 依賴性的通路而誘發炎癥反應，而有相關報道說明，在MiR-155 的多個靶點中，MyD88 被認為是IL-8 調控的靶點，MiR-155 可能通過抑制翻譯而下調蛋白MyD88 的表達進而降低IL-8 的產生［9-10］。經研究表明，幽門螺桿菌感染可促進IL-8 在胃黏膜中過度表達，且IL-8 的高表達與胃癌預后不良呈直接相關［11］。相關研究表明IL-8 rs4073 多態性可能作為亞洲人胃癌的遺傳生物標記物［12］。相關Meta 分析表明，TNF-α基因多態性與胃癌風險有關，尤其是對亞洲人而言［13］。據研究表明，TNF-α-85 7C／T、IL-8-845 T／C 功能多態性均可明顯增加胃癌或慢性胃炎的發生風險，還觀察到多態性C 等位基因攜帶者的IL-8 基因表達水平顯著增高［14］。研究發現，TLR-4 中的rs4986790 和rs4986791 多態性可以作為預測幽門螺桿菌誘發胃癌風險的遺傳標記［15］。這進一步闡明IL-8、TLR-4、TNF-α 均參與誘導炎癥免疫，且在胃癌的進展中起重要作用。由此說明，由慢性胃炎發展至胃癌過程中，必須在幽門螺桿菌感染基礎上通過介導TLR-4 信號通路激活下游靶基因MyD88，使AP-1 轉錄因子產生核易位進而調節IL-8，此時TNF-α 也加速了炎癥反應進程。本研究發現，清熱化濕方干預MNU 聯合幽門螺桿菌感染小鼠后，其胃黏膜組織IL-8、TNF-α 及TLR-4 蛋白和mRNA 表達均呈下降趨勢，提示清熱化濕類方藥可以調控IL-8、TNF-α、TLR-4 表達，發揮防治胃癌的效應。基于本實驗結果，下一步可以從胃癌的靶向分子治療角度，篩選出與TLR-4 信號通路密切相關靶基因，擬采用分子生物技術調控該靶基因下游相關蛋白，并檢測相關指標表達。同時結合清熱化濕方藥進行干預，進一步揭示清熱化濕類方藥干預胃癌的作用機理與有效靶點，開拓中醫藥防治胃癌的新領域。