ω-氯甲基莰烯的高效快速合成及抑菌活性

霍尚朝, 黃道戰, 藍虹云, 林志楠, 陸于州

(廣西民族大學 化學化工學院；廣西林產化學與工程重點實驗室，廣西 南寧 530008)

莰烯是許多植物精油的成分[1]，也是松節油深加工的重要產品[2]，具有抑菌、抗癌、降血脂、驅殺蟲等生物活性[3-7]，對農、林、醫藥行業具有重要的意義。然而，由于其易揮發且親水性弱(不溶于水)，在實際應用中難以發揮應有的功效。為此，人們對莰烯進行分子結構改造或衍生化[8]，引入或構筑具有協同作用或增強親水性、生物活性的基團，合成系列深加工產物。其中，利用Prins烯醛縮合反應合成ω-乙酰氧甲基莰烯及其衍生物，包括ω-羥甲基莰烯、ω-酰基莰烯、ω-酰基莰肟醚等[9-11]。ω-氯甲基莰烯是ω-乙酰氧甲基莰烯的衍生物，分子結構中含有莰烯、烯丙基和氯原子，歸屬于烯丙基氯類化合物。然而，ω-氯甲基莰烯的傳統合成方法[12]是以ω-乙酰氧甲基莰烯為原料，采用堿催化水解、PCl3鹵代反應的兩步化學合成工藝，存在操作工藝復雜、廢棄物多、環境污染嚴重、成本高的問題，限制了ω-氯甲基莰烯的開發利用以及生物活性研究。Yadav等[13]以乙酰氯和無水乙醇作為鹵代反應試劑，通過原位生成HCl，實現了室溫條件下烯丙醇乙酸酯類化合物的高效轉化合成烯丙基氯類化合物。不過，該合成工藝中乙酰氯和無水乙醇的用量較多(n(烯丙醇乙酸酯) ∶n(乙酰氯) ∶n(無水乙醇)高達1 ∶8 ∶8)，成本較高，還易引發副反應。因此，本研究系統考察反應物料比等反應工藝條件對ω-乙酰氧甲基莰烯與乙酰氯和無水乙醇進行鹵代反應的影響規律，并對所合成的ω-氯甲基莰烯進行抑菌活性的研究，為其后續開發利用提供基礎數據。

1 實 驗

1.1 材料、試劑與儀器

莰烯，由廣西梧松林化集團有限公司提供，GC含量97%；ω-乙酰氧甲基莰烯，按文獻[9]方法由莰烯、多聚甲醛、乙酸制備，GC含量 98%；ω-羥甲基莰烯，按文獻[12]方法由ω-乙酰氧甲基莰烯、KOH制備，GC含量97%。大腸桿菌(Escherichiacoli，ATCC-8739)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia，ATCC-4352)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，ATCC-25923)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis，ATCC-6633)、白色念珠菌(Candidaalbicans，ATCC-10231)、熱帶念珠菌(Candidatropicalis，ATCC-13803)和黑曲霉(Aspergillusniger，ATCC-16404)，北京北納創聯生物技術研究院；水解酪蛋白瓊脂(MHA)和馬鈴薯葡萄糖水(PDB)培養基，北京索萊寶科技有限公司。二甲亞砜(DMSO)、氯仿、無水乙醇、乙酰氯、無水硫酸鈉、利福平、酮康唑等，均為市售分析純。

BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌鍋；全自動智能型生化培養箱，重慶市松朗電子儀器有限公司；ZHJH-C1112B超凈工作臺；Xevo G2-S QTof型超高效液相色譜-四極桿-飛行時間串聯質譜(LC-HRMS)儀，美國 Waters 公司；Magna IR550(Ⅱ)型傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)儀,美國Nicolet公司；600M核磁共振波譜(NMR)儀，日本電子株式會社；GC-2014C 型氣相色譜儀和SE2010型氣質聯用儀，蘇州島津儀器有限公司。

1.2ω-氯甲基莰烯的制備

圖1 ω-氯甲基莰烯的合成Fig.1 Synthesis of ω-chloromethyl camphene

ω-氯甲基莰烯的合成工藝路線如圖1所示。稱取0.01 molω-乙酰氧甲基莰烯和0.02 mol無水乙醇置于100 mL圓底燒瓶中混合溶解，邊攪拌邊滴加0.02 mol乙酰氯，然后在30 ℃水浴恒溫攪拌條件下反應5 min。反應結束后，減壓旋轉蒸發除去未反應的乙醇和乙酰氯，向蒸余物加入20 mL蒸餾水分解除去殘存的乙酰氯，以10 mL 氯仿萃取3次；有機相合并，用蒸餾水洗至中性，無水硫酸鈉干燥、過濾，將濾液蒸發回收溶劑氯仿，得到黃褐色黏稠液體。

1.3 產物的分析

1.3.1氣相色譜分析 通過氣相色譜儀進行目標產物的含量測定，檢測所用色譜柱為DB-5 型石英毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)，載氣為N2，檢測器為FID，自動進樣器為AOC-20i，進樣口和檢測器溫度均為 200 ℃；升溫程序：初溫100 ℃，保持 0.5 min，以 5 ℃/min 升溫至 180 ℃，保持 1 min。

1.3.2FT-IR分析 通過傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)儀對目標產物進行紅外光譜分析，采用液膜法。

1.3.3LC-HRMS分析 通過超高效液相色譜-四極桿-飛行時間串聯質譜(LC-HRMS)儀進行質譜分析，掃描范圍m/z50～1000。

1.3.4NMR分析 通過核磁共振波譜(NMR)儀進行1H NMR和13C NMR分析，CDCl3為溶劑，內標為 TMS。

1.4 抑菌活性測試

1.4.1培養基的準備 將2.1 g的MHA培養基和2.6 g的PDB培養基分別置于250 mL三角瓶中，加入100 mL蒸餾水溶解，在121 ℃下滅菌 30 min。

1.4.2樣品母液的配制 準確稱取0.05 gω-氯甲基莰烯，置于5 mL無菌試管中，加入1 mL DMSO 溶解，配制質量濃度為50 g/L 的溶液。取該溶液20 μL與無菌馬鈴薯葡萄糖水培養基溶液0.98 mL混合，得到含 DMSO體積分數為2%、質量濃度為1 000 mg/L 的ω-氯甲基莰烯的母液。 同法配制莰烯、ω-乙酰氧甲基莰烯、ω-羥甲基莰烯、利福平(細菌陽性對照品)和酮康唑(真菌陽性對照品)的母液。

1.4.3菌懸液的配制 取適量菌種(4種細菌和3種真菌)分別加入到 10 mL樣品瓶中，用無菌水稀釋調配成麥氏濁度為0.5的菌懸液，取該菌懸液 50 μL，用相應的無菌培養基稀釋1 000倍，配制成初始菌懸液。

1.4.4抑菌活性測試 參考文獻[14]，采用微量肉湯二倍稀釋法測試。用微量移液器將100 μL含體積分數2% DMSO的無菌培養基溶液加入到96孔平板的2號至12號孔，并將100 μL樣品母液分別加入到1號和2號孔。從2號孔取出100 μL樣品溶液，加入到3號孔，再從3號孔取100 μL樣品溶液加入到4號孔，如此依次在96孔平板上進行2倍稀釋操作，最后的稀釋操作是從12號孔中取出100 μL溶液丟棄，使1～12號孔中樣品溶液質量濃度分別為1 000、 500、 250、 125、 62.5、 31.25、 15.625、 7.812 5、 3.906 3、 1.953 1、 0.976 6、 0.483 3 mg/L。然后，分別向含樣品溶液的1～12號孔加注100 μL初始菌懸液，由此，1～12孔中樣品溶液的最終質量濃度分別為500、 250、 125、 62.5、 31.25、 15.625、 7.812 5、 3.906 3、 1.953 1、 0.976 6、 0.483 3和0.241 7 mg/L。另將100 μL含體積分數為 2% DMSO的無菌培養基溶液與100 μL初始菌懸液混合，配制成空白對照組。將上述96孔平板置于恒溫培養箱培養24 h，其中細菌的培養溫度為37 ℃，而真菌的培養溫度30 ℃，培養結束后比較測試組與空白對照組樣品溶液的渾濁度差異，以不產生渾濁的最低質量濃度作為該樣品相應測試菌的最低抑菌濃度(MIC)。每個樣品對每種測試菌均做3個平行實驗，測試結果取平均值。

2 結果與討論

2.1ω-氯甲基莰烯的結構分析

ω-氯甲基莰烯，分子式C11H17Cl，黃褐色黏稠液體，得率95.2%；FT-IR(KBr)ν/cm-1：3048，2959，2870，1672，1460，660；1H NMR(CDCl3，600 MHz)δ: 5.17～5.19 (dd,J=10.1, 5.9 Hz, 1H, H-10), 4.07～4.14 (dd,J=11.0, 8.0 Hz, 2H, H-11), 3.01～3.02 (d,J=4.5 Hz, 1H, H-4), 1.91～1.92 (m, 1H, H-1), 1.63～1.70 (m, 4H, H-5, H-6), 1.16～1.22 (m, 2H, H-7), 1.03 (s, 3H, H-8), 1.01 (s, 3H, H-9);13C NMR (CDCl3，150 MHz )δ: 163.07(C3), 111.93(C10), 47.94(C1), 42.85(C4), 42.38(C11), 41.43(C7), 37.37(C2), 29.01(C8), 28.16(C9), 25.76(C5), 23.78(C6); LC-HRMS([C11H17]+),m/z:149.1330。

以上波譜分析結果表明：ω-乙酰氧甲基莰烯已發生鹵代反應，生成了目標化合物ω-氯甲基莰烯。

2.2 工藝條件的優化

2.2.1反應時間 在ω-乙酰氧甲基莰烯0.01 mol 、乙酰氯0.02 mol、 無水乙醇0.02 mol、反應溫度為30 ℃條件下，考察了反應時間對目標產物產率的影響，結果如圖2(a)所示。由圖可知，ω-乙酰氧甲基莰烯可與乙酰氯進行快速的鹵代反應，生成ω-氯甲基莰烯，反應時間對轉化率的影響不大，而對產率影響較大。反應僅進行5 min，轉化率和產率已分別達到97.5%和95.2%；隨著反應時間的延長，轉化率緩慢增加，但產率逐漸降低，反應進行25 min時，產率降低至65%。采用氣質聯用儀對反應混合物進行化學組成分析，發現烯丙基醚類化合物的存在，表明ω-乙酰氧甲基莰烯與乙酰氯的鹵代反應有副產物烯丙基醚類化合物生成，而且隨著反應時間延長，副產物的量增多，產率降低。因此，乙酰氯與ω-乙酰氧甲基莰烯的鹵代反應時間宜控制在5 min內完成。

a.反應時間reaction time; b.反應溫度reaction temperature;c.乙酰氯用量 dosage of acetyl chloride; d.無水乙醇用量dosage of ethanol

2.2.2反應溫度 在ω-乙酰氧甲基莰烯 0.01 mol、乙酰氯0.02 mol、無水乙醇0.02 mol、反應時間為5 min 條件下，考察了反應溫度對目標產物產率的影響，結果如圖2(b)所示。由圖可知，在20～40 ℃溫和條件下，乙酰氯與ω-乙酰氧甲基莰烯的鹵代反應就能快速進行，反應溫度的變化對原料轉化率和目標產物產率有一定的影響但影響不大，隨反應溫度增加，轉化率緩慢增加并趨近完全轉化。溫度由20 ℃升至30 ℃，反應產率由92.5%增加至95.2%，溫度高于30 ℃，產率逐漸降低。因此，反應溫度選擇30 ℃為宜。

2.2.3乙酰氯用量 在ω-乙酰氧甲基莰烯 0.01 mol、無水乙醇0.02 mol、反應溫度為30 ℃、反應時間為5 min條件下，考察乙酰氯用量對反應的影響，結果如圖2(c)所示。由圖可知，乙酰氯用量對反應有很大影響，當乙酰氯用量為 0.01 mol時，反應不完全，反應轉化率和產率均小于80%；隨著乙酰氯用量增至 0.02 mol，反應轉化率和產率逐漸升高到最大值，分別達到97.5% 和95.2%；繼續增加用量，反應轉化率變化不大，但產率逐漸降低。究其原因，可能是乙酰氯用量較多時，原位生成的HCl過多，反應體系酸性太強，促使產物ω-氯甲基莰烯發生進一步的加成、聚合、異構等副反應。因此，乙酰氯用量選擇 0.02 mol為宜。

2.2.4無水乙醇用量 在ω-乙酰氧甲基莰烯 0.01 mol、乙酰氯 0.02 mol、反應溫度為30 ℃、反應時間為5 min的條件下，考察無水乙醇用量對反應的影響，結果如圖2(d)所示。由圖可知，無水乙醇用量對反應的影響較大，當無水乙醇用量小于 0.02 mol，無水乙醇用量不足，反應轉化率和產率較低，隨著無水乙醇用量增加，反應轉化率和產率逐漸提高。當無水乙醇用量大于 0.02 mol時，無水乙醇用量過多，原料轉化率和產率逐漸降低。因此，適宜的無水乙醇用量為0.02 mol，轉化率和產率分別為97.5%和95.2%。

綜合考慮，較佳的反應條件為ω-乙酰氧甲基莰烯 0.01 mol，乙酰氯 0.02 mol，無水乙醇 0.02 mol，反應溫度30 ℃，反應時間 5 min。此條件下ω-乙酰氧甲基莰烯轉化率為97.5%，ω-氯甲基莰烯產率為95.2%。

2.3ω-氯甲基莰烯的抑菌活性

ω-氯甲基莰烯、ω-乙酰氧甲基莰烯、ω-羥甲基莰烯和莰烯對4種細菌(革蘭氏陰性菌：大腸桿菌和肺炎克雷伯菌；革蘭氏陽性菌：金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌)和3種真菌(白色念珠菌、熱帶念珠菌和黑曲霉)的抑菌活性實驗結果列于表1。由表1可知，ω-氯甲基莰烯對供試細菌和真菌的生長均有明顯的抑制作用，其抑菌活性明顯高于莰烯、ω-乙酰氧甲基莰烯和ω-羥甲基莰烯。其中，ω-氯甲基莰烯對金黃色葡萄球菌的生長抑制作用最強，最低抑菌質量濃度(MIC)達到15.63 mg/L；對3種真菌的生長抑制作用也較強，MIC均為31.25 mg/L；而對其他3種細菌的生長抑制作用稍弱，MIC在62.5～250 mg/L之間。莰烯、ω-乙酰氧甲基莰烯和ω-羥甲基莰烯對細菌和真菌的生長抑制作用較弱，MIC均大于125 mg/L。

表1 ω-氯甲基莰烯對細菌和真菌的抑菌活性1)

1)a.利福平rifampicin; b.酮康唑ketoconazole

與陽性對照品相比較，除白色念珠菌外，ω-氯甲基莰烯對其他供試細菌和真菌的抑制作用均弱于陽性對照品。不過，ω-氯甲基莰烯含有化學活性的烯丙基氯結構，容易通過引入構筑具有協同作用或增強親水性和生物活性的含氮、氧或硫的功能基，改善其使用性能，拓展其新的應用領域。

3 結 論

3.1以ω-乙酰氧甲基莰烯為原料，乙酰氯和無水乙醇為鹵代反應試劑，制得ω-氯甲基莰烯；產物經FT-IR、LC-HRMS、1H NMR和13C NMR的波譜結構表征確證。通過單因素試驗得到較佳的合成工藝條件為ω-乙酰氧甲基莰烯0.01 mol、 乙酰氯0.02 mol、 無水乙醇0.02 mol、反應溫度30 ℃、反應時間5 min，該條件下ω-乙酰氧甲基莰烯轉化率和ω-氯甲基莰烯產率分別高達97.5%和95.2%。

3.2ω-氯甲基莰烯對4種細菌(大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌)和3種真菌(白色念珠菌、熱帶念珠菌、黑曲霉)均有明顯的抑制作用，對4種細菌的最低抑菌質量濃度(MIC)依次為 125、 62.5、 15.63、 250 mg/L，對3種真菌的MIC均為 31.25 mg/L，抑菌活性優于莰烯、ω-乙酰氧甲基莰烯和ω-羥甲基莰烯。ω-氯甲基莰烯含有莰烯分子結構和烯丙基氯結構，具有活潑的化學反應活性，易于引入構筑含氮、氧、硫等的生物活性功能基。