糖苷類化合物非水相生物催化結構修飾的研究進展

楊榮玲，吳婷婷，趙祥杰，聶澤坤，王朝宇

(淮陰工學院 生命科學與食品工程學院，江蘇 淮安 223003)

糖苷是糖的半縮醛羥基與配體縮合而形成的含糖衍生物，糖基一般為單糖或多糖，而配體的結構可以是簡單的中等長度的脂肪醇，也可以是復雜的生物大分子如蛋白質[1]。糖苷類化合物廣泛存在于自然界中，具有多種生理活性，在生物、醫藥、食品、化妝品等領域均有著廣闊的應用前景。但糖苷類化合物普遍存在著穩定性低、脂溶性差等缺點，可以通過對糖苷類化合物分子進行結構修飾和分子改造，增加其結構和功能的多樣性，改善糖苷類化合物脂溶性和穩定性等，大大提升其生物利用度。

結構修飾方法以化學法和生物催化法為主，目前化學法應用較為廣泛，但反應往往選擇性差，反應體系易造成環境污染，反應產物復雜且分離純化較為困難。生物催化法則以酶法為主，酶法較化學法具有條件溫和、專一性強等優點，因此越來越受到人們的關注。傳統上認為酶催化反應是在水介質中進行的，但許多有機化合物底物在水中的溶解性較差。隨著對酶的深入研究，發現酶催化反應也能在非水相系統中進行[2]。酶在非水介質中催化反應相較于水相的優點很多，諸如能催化在水中不能進行的反應、可以提高酶的熱穩定性、酶和產物易于回收、可避免微生物污染等[3],因此，非水相催化酶學研究已成為酶學、酶工程的一個重要方向。目前，通過非水相生物催化對糖苷類化合物進行結構修飾已引起國內外學者的廣泛關注，新型催化劑的設計與應用和基于溶劑工程的新型溶劑體系的引用帶動了非水相催化研究地不斷深入，多種糖苷類化合物獲得結構修飾并產生了新的性狀[4]。作者從催化劑種類、催化介質、結構修飾的方法、結構修飾對功能的影響及其應用等方面對非水相生物催化糖苷類化合物結構修飾的現狀進行綜述，展現出結構修飾在改善糖苷類化合物脂溶性和穩定性方面良好的研究前景。

1 非水相生物催化

1.1 催化劑種類

1.1.1游離酶 游離酶是處于游離狀態的酶分子，是催化反應中最常見的一種酶制劑形式,易溶于水，與底物作用面積大。在生物催化反應中使用純酶能夠對所選反應具有特異性，裝置和操作簡單并且對用于增溶的共溶劑具有更高的耐受性[5]。因此，在一步反應中，使用純化的游離酶顯示出較高的專一性，不會發生副反應，并且底物不必跨膜轉運。隨著蛋白質和基因工程技術的發展，推動了純酶制劑的應用。其中，用于糖苷結構修飾的糖苷酶幾乎存在于一切生物體中，其底物適應性寬，可直接以非保護或非活化的糖作為糖基供體直接催化合成糖苷類物質，如β-糖苷酶可用于紅景天苷的合成[6]，苦杏仁苷酶可用于芳香基葡萄糖苷的合成[7]，β-葡萄糖苷酶可用于烷基及芳基糖苷的合成[8]，α-葡萄糖苷酶可用于槲皮苷的合成[9]，二糖苷酶可用于陳皮苷的水解[10]。然而，酶的分離和純化可能非常昂貴并耗時，反應過程中可能需要添加輔因子，反應結束后需要對酶進行回收利用，有些反應可能需要多種酶共同完成，這些都是應用過程中的困難，限制了游離酶的使用。

1.1.2固定化酶 游離酶因具有的高催化活性、選擇性、特異性和可生物降解性而深受青睞[11]，但存在不能回收和再利用難題[12],而通過將酶固定化則使酶容易回收。固定化酶是指通過物理或化學法把酶束縛在一定空間內且仍具有酶活性的一種酶制劑，固定化酶易于與底物分離，可以實現酶促反應快速終止，也能重復進行酶反應，從而顯著降低測定成本，還能提高儲存穩定性，pH穩定性和耐熱性,已被廣泛應用于制藥工業、食品工業、污水處理和紡織工業等各個領域。Kontogianni等[13]以蘆丁、柚皮苷為底物，3種不同鏈長的脂肪酸酯為酰基供體，在南極念珠菌脂肪酶的催化下合成了一系列類黃酮脂肪酸酯。Patil等[14]選用來自熒光假單胞菌的脂肪酶AK，催化穿心蓮內酯合成了2種更具抗菌活性的穿心蓮內酯-14-丙酸酯和穿心蓮內酯-14-己酸酯。但同時，固定化酶也存在固定化操作損失酶活力，不適宜于多酶反應體系，不適合與大分子物質反應，固定化制備成本高等缺點。

1.1.3全細胞催化劑 全細胞催化劑是利用完整的微生物細胞作為催化劑進行生物轉化反應。全細胞催化劑的酶活性高且穩定性強，通過細胞培養即可獲得，操作簡單，同時也避免了分離純化等步驟，能顯著降低酶制劑的使用成本。Tufvesson等[15]在生物催化劑的成本研究中發現，純化酶比全細胞催化劑貴10倍。此外，相比于單一純酶只能進行一步或一類反應，全細胞催化劑能夠完成多步反應[5]。全細胞催化劑最主要的優點是能夠給酶提供一個天然環境，使酶對于體系中水分含量的要求不苛刻，同時更具穩定性從而避免酶在非水溶劑中快速失活[16]。隨著對全細胞催化研究的不斷深入，新型全細胞催化劑也不斷地被發現。目前，全細胞催化劑已被廣泛應用于生物柴油生產、手性分子拆分、核苷類化合物酰化修飾等方面[5,17]。

全細胞催化劑已經在生物柴油工業化生產中得到廣泛使用，可以減少生物柴油生產過程中的操作步驟，易于分離副產物甘油，顯著降低了生產成本[18]；由于全細胞催化劑具有高度的對映選擇性和區域選擇性，在手性化合物生產中有越來越多的應用[5]，如Ye[19]等研究了重組全細胞催化劑在磷酸鉀緩沖液和丁酸乙酯雙相體系中催化合成手性藥物中間體(S)-4-氯-羥基丁酸乙酯。此外，核苷類化合物作為在抗病毒和抗腫瘤等方面的重要藥物，已經越來越多地被利用全細胞催化劑合成。Feng等[20]利用葡萄糖和丙酸乙烯酯在施氏假單胞菌凍干細胞的催化下成功合成了6-O-丙酰基-D-葡萄糖，反應具有較高的轉化率(97.2%)和6-區域選擇性(>99%)。練妍[21]利用熒光假單胞菌和米曲霉全細胞為催化劑成功催化5-氟尿苷與月桂酸乙烯酯合成了5-氟尿苷酯。Yang等[22]利用米曲霉全細胞催化劑在異丙醚-吡啶體系中催化合成阿糖胞苷的3′-O-丙氨酸衍生物，轉化率達到83%。胡霞艷[23]以畢赤酵母表面展示DC-BGL為催化劑，首先將葡萄糖逆水解生成丁基β-D葡萄糖苷(BD)，再以BD為糖基供體，正辛醇為糖苷供體，轉糖苷合成辛基β-D葡萄糖苷(OG)，轉化率最高為51.1%。雖然全細胞催化比酶催化具有更經濟、更環保的優勢，但存在催化反應的不確定性、細胞膜對底物的透過性差異以及副產物的累積等缺點[24]。

1.2 非水相介質體系

1.2.1有機溶劑體系 有機溶劑中的酶催化指酶在含有一定量水的有機溶劑中進行的催化反應。自1984年Zaks和Klibanov研究發現脂肪酶在有機溶劑中存活，并具有較高的熱穩定性和催化活性后，酶在有機溶劑中的催化作用取得了快速發展[25]。酶在有機溶劑中的催化反應已成為生物技術領域的一個主要研究領域，受到國內外學術界的廣泛關注[26]。有機溶劑體系中的酶能夠催化在水溶液中受熱力學限制而不能進行的反應，有機溶劑中酶促反應條件溫和，酶的穩定性大大提高，并可防止因水引起的酶水解副反應，大幅減少副產物，使得目標產物分離更為容易。Yang等[27]利用Lipozyme TLL在四氫呋喃中催化合成了一系列豆腐果苷脂肪酸酯衍生物，區域選擇性大于99%。

1.2.2無溶劑體系 無溶劑體系是酶催化反應中無需加入其他有機溶劑，酶直接作用于底物的反應體系，可作為取代傳統有機溶劑最徹底的綠色方法[28]。無溶劑體系具有底物濃度高、反應速度快等特點，且無需分離反應溶劑，減少了產物分離提純的步驟，使純化容易，同時降低了對環境的污染。在無溶劑體系中，通過適當提高反應溫度可提高酶反應速率。

1.2.3離子液體體系 離子液體實質上是凝固點較低，室溫下呈液態的鹽。離子液體有著較低的蒸氣壓、高穩定性以及環境友好等特點，是一種新穎的綠色溶劑[29]。離子液體通常按陰陽離子分類，也可按水溶性分為親水性和憎水性離子液體，此外，還可按酸堿性分類。為了研究離子液體對酶活性和穩定性的影響，合成了各種各樣的親水性和疏水性離子液體[30]。在大多數情況下，疏水離子液體因能對酶分子起保持穩定性的作用，使其在酶促反應中表現出更好的性能[31]。

離子液體作為有機溶劑的綠色替代品，最近成為各種生物催化過程的新型有效溶劑，開辟出一個新興的非水相酶學領域，在生物催化領域成為研究熱點。Yang等[17]研究出新的含有離子液體[BMI] [PF6]/THF的反應體系，利用熒光假單胞菌全細胞催化劑催化合成了長鏈核苷酸酯，產物收率達到81.1%，5′-區域選擇性大于99%。

1.2.4超臨界流體介質體系 超臨界流體是指溫度和壓力超過某物質超臨界點的流體，研究表明：利用超臨界流體作為酶催化親脂性底物的溶劑時，酶相對穩定并可用于催化酯化、水解、轉酯等反應[32]。常用的超臨界流體有CO2、H2O、NH3、C2H4等，其中超臨界CO2流體價廉、無毒，反應物具有較高的擴散度和相對較低的黏度，同時底物更易溶解，反應速率更快，因此適用于酶催化反應的進行。但該體系需要使用高壓容器，減壓時易使酶失活[33]。此外，超臨界CO2也可能會和酶分子表面的活潑基團發生反應從而導致酶活性的喪失。

2 糖苷類化合物結構修飾的現狀

2.1 糖苷類化合物結構修飾方法

2.1.1去糖基化修飾 糖苷類化合物是由苷元和糖基通過不同糖苷鍵連接而成，通過去糖基化修飾得到的苷元較糖苷親脂性更高,更易進入生物膜疏水層的內核，從而改變其生物活性。研究表明：黃酮糖苷經去糖基化修飾形成黃酮苷元，其清除自由基的能力以及抗氧化活性與黃酮糖苷相比更優，生物利用率大大提高[34]。橙皮苷的苷元具有鎮痛、抗炎、抗氧化等特性，還能作為生產染料和甜味劑的基本原料[10]。然而，糖基化黃酮類化合物的低溶解度是在水性介質中進行有效地酶促去糖基化的障礙。為了克服這個缺點，通常使用對環境不友好的二甲基亞砜(DMSO)作為共溶劑。近年來，低共熔溶劑(DES)作為一種新型綠色、溶解度好的反應介質引起了學者的廣泛關注，Weiz等[10]選用二糖苷酶在由氯化膽堿和甘油或乙二醇組成的DES中對橙皮苷進行去糖基化修飾，顯示出較高的類黃酮溶解度和高酶活性。

2.1.2糖基化修飾 天然產物通過糖基化、乙酰化、甲基化等修飾方法可提高結構的復雜性和多樣性，在一定程度上可改善天然產物的成藥性，其中糖基化修飾對增加溶解性和穩定性的效果極為顯著[35]。糖基化修飾是指利用糖基轉移酶將葡萄糖基轉移到糖苷類化合物的母體或糖基上以達到修飾的目的。天然糖苷類化合物經糖基化修飾能增加結構和功能的多樣性，還可以增加其溶解度，提高生物利用度，減少毒副作用，形成高活性及低毒性的天然活性先導化合物。Ko等[36]選用來自蠟狀芽孢桿菌的UDP-糖基轉移酶對柚皮素的4-羥基上進行糖基化修飾，得到柚皮素-4′-O-葡萄糖苷，溶解性得到提高。Malla等[37]在大腸桿菌中引入大豆中的糖基轉移酶，以柚皮素為底物，合成了山奈酚-3-O-葡萄糖苷，研究表明，其能抑制雌二醇代謝生成的4-羥基雌二醇致癌代謝物，具有抗腫瘤作用，但其抑制效果比山奈酚有所降低[38]。由此可見，糖基化修飾主要作用是增加產物溶解度。目前，對天然糖苷類化合物的糖基化修飾已經成為當今新藥研制領域的熱點。

2.1.3酰化修飾 酰化修飾是通過引入一個或多個有機酸分子與化合物糖苷基團上的羥基進行反應形成不同取代的酰基糖苷。酶法酰化是糖苷類化合物結構修飾的一種有效手段，其反應條件溫和，在常溫下能高效催化酰化反應，并可定向合成具有特定結構的酯類衍生物。當糖環的羥基連接上脂肪族或芳香族酰基時，可增強化合物的脂溶性，提高糖苷化合物的利用度。

黃酮苷類化合物可通過南極假絲酵母脂肪酶B和枯草桿菌蛋白酶在黃酮糖苷上糖基的醇羥基位點進行酰化修飾以提高其親脂性并引入各種有益的性能[39]。柚皮苷作為一種雙羥基黃酮類化合物，主要存在于葡萄柚和柑橘類水果中，具有抗氧化、抗炎、保肝等生物活性，因此受到了醫藥和功能性食品工業的廣泛關注。然而，柚皮苷的實際應用因其在脂質環境中溶解度和穩定性較差而受到限制[40]。Zhang等[40]選用固定化脂肪酶(Novozym 435)作為催化劑，將柚皮苷與棕櫚酸在叔戊醇、丙酮和正己烷3種溶劑中進行酰化反應，均成功得到了柚皮苷棕櫚酸酯，且在叔戊醇中轉化收率最高。

熊果苷作為一種簡單的多酚，可以從多種天然植物中提取，并具有各種重要的生物活性。含有熊果苷的植物物質主要用于治療尿路感染，部分研究發現熊果苷具有阻止黑色素生成的活性，可用于治療色素沉著過度[41]。此外，通過熊果苷結構的改變可導致上述活性的增加。Yang等[41]選用擴展青霉脂肪酶成功地合成了一組新的芳香族酯類熊果苷，其具有優良的6′-區域選擇性(>99%)和較好的分離產率(68%～93%)。Jiang等[42]以乙酸乙烯酯為酰基供體，假絲酵母脂肪酶為催化劑，在四氫呋喃有機溶劑體系中催化熊果苷區域選擇性酰化反應(圖1)，在熊果苷的葡萄糖部分的C-6′位置顯示出高度特異性，反應24h后轉化率可達(91.42±2.43)%。

圖1 假絲酵母脂肪酶催化熊果苷區域選擇性酰化反應[42]

2.1.4甲基化修飾 通過在糖苷分子酚羥基引入醇羥基并縮合，形成甲基化修飾的糖苷可以提高糖苷類化合物的生物活性，提高生物利用度。黃酮類化合物甲基化修飾具有空間選擇專一性。橙皮苷3′位酚羥基被甲基化生成甲基橙皮苷，其水溶性好，以其為原料的藥物可防止動脈硬化所引起的血管紊亂[43]。目前利用非水介質對糖苷類化合物進行甲基化修飾的研究相對較少。

2.2 結構修飾對糖苷類化合物性質的影響

2.2.1溶解度提高 糖苷類化合物通過結構修飾可有效增強其水溶性，提高其在人體內的代謝活性。Calias等[44]研究發現槲皮素通過糖基化修飾后，其水溶性提高了30多倍，抗腫瘤活性也得到增強。酰化修飾在改變糖苷類化合物多羥基結構的同時，不僅可以改善其水溶性，還可提高其脂溶性，提高細胞膜的親和力，從而提高其生物利用度。Cruz等[45]在研究測定兒茶素、原花青素B4和錦葵花素-3-葡萄糖苷的酯類衍生物抗氧化活性的同時發現其均具有脂溶性強的優點，可促進該類衍生物運輸到細胞目標物，提高其生物利用度。袁亭亭[46]測定了葛根素及其酯類衍生物的正辛醇-水分配系數，發現油水分配系數都較親代化合物有所增加，并隨酰基供體鏈長的增長而逐漸變大，有效地證明了酰化修飾可增加親代化合物的脂溶性。

2.2.2穩定性增強 與微膠囊化包裹技術實現糖苷類化合物穩定性提升的機理不同，經結構修飾后的糖苷類化合物主要受到修飾基團的影響，減輕了介質水對母核的作用而產生的基團重組，從而保持了其結構穩定性[47]。花青素作為一種色素廣泛分布于植物體內，具有抗癌抗腫瘤、保護視力、調節血脂等多種功效，但由于穩定性較差限制了其廣泛應用,而通過酰化作用得到的多酰基化修飾的花青素分子，可以在疏水作用力的影響下使花青素母核分子夾在酰基基團形成的層狀結構中間，形成類似于“三明治”的結構，可以提高花青素的穩定性，擴大花青素的應用范圍，但花青素的酰化位點以及酰基類型、數量和性質的不同均會對酰化花色苷的穩定性產生不同程度的影響[48]。Yan等[49]利用南極假絲酵母脂肪酶B對黑米中花色苷進行酶促酰化，成功合成了矢車菊素-3-6″-苯甲酰葡萄糖苷、矢車菊素-3-6″-水楊酰葡萄糖苷和矢車菊素-3-6″-肉桂酰葡萄糖苷(圖2)，酰化修飾產物的穩定性均得到改善，其中肉桂酰化后的產物穩定性最好。

圖2 飛燕草素3-葡萄糖苷(1)及其3種酰化衍生物的結構[49]

2.2.3生物活性提升 糖苷類化合物通過結構修飾不僅可以改善其溶解度和穩定性，還可增強其功能的多樣性，提高其生物活性。通過結構修飾能夠有效增強糖苷類化合物的抗氧化活性。李路寧等[50]通過測定酰化藍莓花青素清除自由基、清除超氧陰離子和抑制脂質體過氧化的能力，發現沒食子酸酰化花青素的抗氧化性可得到有效提升。霍彥雄等[51]通過固定化酶催化合成根皮苷豆蔻酸酯，其抑制脂質氧化、清除H2O2和HClO能力明顯要優于親代化合物，說明結構修飾可提高親代化合物的體外抗氧化能力。

2.3 糖苷類結構修飾化合物的應用

糖苷類化合物在天然環境中的來源非常豐富，且具有多種生物活性，因此在食品、醫藥、日化、印染、農藥等領域具有較為廣泛的應用。而通過對天然糖苷類化合物進行結構修飾，改善其脂溶性、穩定性以及生物活性，可以更加拓寬其應用領域，并能取得更優的使用效果。Xanthakis等[52]通過酰化反應生成蘆丁酯類衍生物，檢測其對人類白血病細胞K562生成VEGF的影響，發現蘆丁酯類衍生物具有抗血管生成特性，在腫瘤防治中具有潛在的應用前景。熊果苷的衍生物6′-O-咖啡酰基熊果苷較親代化合物抑制黑色素能力更強、毒性更弱的特點，能夠起到美白淡斑的功效，在化妝品和醫藥領域具有應用前景[53]。擁有防治心腦血管疾病的葛根素目前已用于臨床治療，但其脂溶性差，不易透過血腦屏障，導致藥物利用度低，葛根素經酰化修飾得到的乙酰葛根素脂溶性得到明顯增加，能夠抑制細胞凋亡，起到神經保護作用[54]。

3 展 望

利用非水相介質對糖苷類化合物進行結構修飾已取得可喜進展，通過去糖基化修飾、糖基化修飾、酰化修飾、甲基化修飾等方法可有效改善糖苷類化合物的脂溶性、穩定性等特性。但是，許多研究工作仍停留在實驗室階段，轉化率較低極大地限制了糖苷類化合物的工業化生產。針對當前結構修飾研究中存在的困境，一方面要篩選具有高催化活性和穩定性的催化劑，可以通過從植物來源和微生物來源中篩選專用催化劑，也可以通過分子生物學和酶工程方法進行重組和改造酶，獲得具有較高實用價值的催化劑；另一方面也可以設計或篩選性質優良的催化介質，如新型低共熔溶劑和離子液體的設計等，從而改善非水相條件下糖苷類化合物的結構修飾性能。通過進一步的努力，非水相生物催化糖苷類化合物結構修飾技術必將取得驚人的進步。