1-脫氧野尻霉素控釋微丸的制備工藝優化及其藥動學研究

孫照英, 趙華南, 劉志明*

(1.東北林業大學 材料科學與工程學院, 黑龍江 哈爾濱 150040; 2.哈藥集團技術中心, 黑龍江 哈爾濱 150020)

1-脫氧野尻霉素是一種從桑葉中提取的哌啶生物堿，屬于糖的類似物。1-脫氧野尻霉素作為細胞色素P450單加氧酶同種型3A和P-蛋白的抑制劑，具有抗癌、抗炎和抗氧化等多種藥理活性，此外，其作為抑制α-葡萄糖苷酶活性的競爭性抑制劑已廣泛應用于臨床中，用于治療各種疾病，尤其是治療非胰島素依賴型(II型)糖尿病[1-2]。由于1-脫氧野尻霉素還具有半衰期短、首過效應明顯、水溶性差、對胃腸道有刺激作用和生物利用度較低等特點[3]，實際使用中一般通過增加劑量和使用頻次來提高其生物利用度，會導致患者依從性差。目前脂質體和納米乳劑已被用于溶解1-脫氧野尻霉素以增強口服生物利用度[4-6]，但未發現控制微丸劑型的相關報道。由于傳統制劑很容易達到過高的血藥濃度使血糖下降過快，引起低血糖導致頭暈和昏迷，并影響藥物的吸收導致低生物利用度。而口服控釋制劑通過緩慢釋放藥物，能夠控制穩定的血藥濃度并延長作用時間，從而改善口服生物利用度，并減少對胃腸道的刺激[7-8]。因此，口服控釋制劑的研究已成為治療糖尿病新藥領域的熱點。作為載藥系統，微丸具有獨特的臨床優勢，如微丸在胃腸道中自由分散、最大限度地增加藥物吸收、減少血藥波動和減少潛在的副作用，從而提高藥物的生物利用度[9-11]。本研究將1-脫氧野尻霉素與輔料羥丙基甲基纖維素E50、微晶纖維素、異丙醇進行混合，通過擠出滾圓法制備1-脫氧野尻霉素丸芯,再采用羥丙基甲基納米纖維素鄰苯二甲酸酯作為主要控釋包衣材料進行包衣，將該微丸裝入膠囊后，進行了藥物體外溶出和體內控釋及相關性的研究，以期為1-脫氧野尻霉素在糖尿病中的臨床用藥提供基礎數據。

1 實 驗

1.1 材料與試劑

1-脫氧野尻霉素原料藥，哈藥集團制藥六廠；1-脫氧野尻霉素對照品(純度99.4%)，中檢院；羥丙基甲基納米纖維素鄰苯二甲酸酯、羥丙基甲基纖維素E50和聚乙烯吡咯烷酮K30，德國BASF公司；聚乙二醇6000、微晶纖維素和滑石粉，安徽山河制藥有限公司；2號羥丙甲纖維素膠囊，蘇州膠囊有限公司；乙腈和甲醇，均為色譜級；肝素鈉、異丙醇、α-萘酚、磷酸二氫鉀、磷酸、乙酸、鹽酸，均為分析級。

健康比格犬18只，由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供，體質量(13±2) kg。

1.2 1-脫氧野尻霉素與輔料相容性分析

將1-脫氧野尻霉素、羥丙基甲基納米纖維素鄰苯二甲酸酯、微晶纖維素、羥丙基甲基纖維素E50、聚乙烯吡咯烷酮K30、聚乙二醇6000和滑石粉按質量比1 ∶1 ∶1 ∶1 ∶1 ∶1 ∶0.5進行混合,將樣品放置于溫度40 ℃、濕度75%的恒溫恒濕箱中1個月。取含1-脫氧野尻霉素25 mg的放置后的樣品置于100 mL棕色容量瓶中，加入100 mL純水、乙醇和異丙醇體積比1 ∶1 ∶1的混合溶液將其溶解,超聲波分散處理5 min。將混合液在離心機中以8 000 r/min轉速離心10 min。取5 mL上清液用上述混合溶液稀釋至50 mL并注入美國Agilent1260高效液相色譜(HPLC)儀中。色譜條件：流動相為甲醇、乙腈和水體積比450 ∶550 ∶2.5的混合液，色譜柱Phenomenex C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫為30 ℃，檢測波長215 nm，進樣量10 μL，流速為1.0 mL/min。以1-脫氧野尻霉素峰面積(A)對標準血藥質量濃度(c,mg/L)進行線性回歸分析，質量濃度在1～25 mg/L范圍內，其方程為c=20.742A-2.437 32(R=0.999 7)，檢測限為25 μg/L，定量限為70 μg/L。

1.3 1-脫氧野尻霉素控釋微丸的制備

1.3.1分散體的制備 將400 g聚乙烯吡咯烷酮K30和800 g 1-脫氧野尻霉素原料藥放入2 L乙醇中，使用旋轉蒸發儀在65 ℃蒸發混合物直至處于黏性狀態。隨后，殘留的乙醇溶劑在80 ℃下完全揮發，將混合物置于-30 ℃的冰箱中冷凍6 h得到固化物。將固化物在真空干燥箱中干燥12 h，通過小型粉碎機粉碎成粉末，過200 μm篩網，并儲存在干燥器中。

1.3.2丸芯的制備 稱量分散體粉末1 500 g、微晶纖維素400 g和羥丙基甲基纖維素 E50 200 g，置于Y150擠出滾圓機中，并使用0.8 L異丙醇作為潤濕劑均勻混合，攪拌槳轉速為75 r/min，剪切刀轉速為850 r/min。將濕物料加入擠壓滾筒中，通過螺旋鉆的旋轉將物料轉移到網板上，通過擠壓裝置擠出，材料通過孔徑為400 μm的網孔板擠出成條狀，擠出速度為50 r/min。將條狀物置于圓形轉盤中，轉盤速度為900 r/min，物料溫度為55 ℃，制成丸芯,然后將丸芯通過600 μm篩網。為了研究羥丙基甲基纖維素E50對藥物溶出的影響，將2%、 4%和6%的羥丙基甲基纖維素E50(以丸芯質量計)用于制備微丸。

1.3.3隔離層的制備 取200 g聚乙二醇6000和4 g滑石粉加入2 L水中，不斷攪拌直至其溶解，使用WBF-2G底噴霧流化床將溶液噴霧到丸芯上，工藝參數為噴霧速率8～9 mL/min，霧化壓力100～120 kPa，空氣流量60～70 m3/h，蠕動泵轉速35～40 mL/min，入口溫度50～60 ℃，出口溫度50～55 ℃，空氣源壓力450～500 kPa,隔離層厚度約為80 μm。通過700 μm篩網來篩分顆粒，除去大顆粒。

1.3.4控釋微丸的制備 取600 g羥丙基甲基納米纖維素鄰苯二甲酸酯和200 g聚乙二醇6000溶解在2 L純凈水中，使用流化床側噴1.3.3節中制備的含隔離層丸芯制備控釋微丸。工藝參數：噴霧速率7～8 mL/min，霧化壓力120～150 kPa，空氣流量70～80 m3/h，蠕動泵轉速40～45 mL/min，入口溫度50～55 ℃，出口溫度45～55 ℃，空氣源壓力500～600 kPa。控釋微丸過850 μm篩網來篩分顆粒，除去大顆粒。

1.3.5裝膠囊 將制備的控釋微丸裝入2號羥丙甲纖維素膠囊殼中。裝量約為240 mg(含40 mg 1-脫氧野尻霉素)，裝量差異為3%。

1.4 控釋微丸的結構表征與性能測試

1.4.1性質測定 通過HPLC法測定微丸中1-脫氧野尻霉素的量，檢測方法同1.2節;使用沉降漏斗法[12]來檢測休止角;將20 g 微丸加入脆碎度儀中，以100 r/min的轉速旋轉4 min，測量質量損失的百分比;采用振實法檢測振實密度和松密度[13];采用卡爾費休法檢測水含量[14];采用篩分法檢測粒度分布[15];通過氣相色譜檢測殘留溶劑，并通過外標法計算異丙醇含量(根據中國藥典，微丸的殘留溶劑不得超過0.5%)。具體方法為使用5890型氣相色譜儀，配有熔融石英毛細管柱(25 m×0.2 mm，0.25 μm),氦氣作為載氣，流速0.55 mL/min，進樣體積3 μL,噴射器溫度程序從65 ℃開始(保持2 min)，然后以80 ℃/min 的升溫速率增加至360 ℃，并在此溫度保持10 min。

控釋微丸的產率見式(1)：

微丸的產率=微丸的實際產率/微丸的理論產率×100%

(1)

1.4.2SEM分析 采用美國485VP型掃描電子顯微鏡(SEM)觀察微丸的表面和橫截面。

1.5 控釋微丸體外釋藥試驗

1.5.1溶出介質的影響 根據中國藥典[16]采用上海天士利儀器有限公司生產的ZRS-8G溶出儀研究釋放曲線。選擇4種不同pH值的溶液作為溶出介質：pH值1.2鹽酸溶液、 pH值4.0醋酸鹽溶液、pH值5.5醋酸鹽溶液和pH值6.8磷酸鹽溶液。將膠囊分別放入以上溶出介質中，槳葉旋轉速度為50 r/min，介質體積900 mL,溫度為(37±0.5) ℃。以適當的時間間隔(0.5、 1、 2、 4、 6、 8、 12、 18和24 h)，分別取出10 mL溶出介質，過0.22 μm的濾膜，每次取出后在相同溫度下補充相同體積的溶出介質，采用美國Cary 50 Conc紫外分光光度計檢測取出的溶出介質中1-脫氧野尻霉素含量，波長設定為215 nm。對6粒膠囊進行平行溶解實驗，并計算每個時間點溶出介質的平均累積溶出度和標準偏差。

1.5.2溶出穩定性研究 取連續3批微丸膠囊樣品進行溶出穩定性試驗，分別為未放置、長期放置12個月(溫度25 ℃和濕度50%)和加速放置6個月(溫度40 ℃和濕度75%)，檢測體外溶出曲線，觀察有無變化。

1.5.3釋藥模型擬合 對1-脫氧野尻霉素控釋微丸溶出度進行不同的釋放模型的數據擬合，通過WINNNONLIN 5.2版計算機軟件計算和確認1-脫氧野尻霉素釋放機制。采用零級模型(式(2))、一級模型(式(3))、Ritger-Peppas(式(4))、Higuchi(式(5))、Weibull(式(6))和Baker-Lonsdale模型(式(7))進行回歸分析，并且計算相關系數(R)，用于評價1-脫氧野尻霉素釋放曲線的擬合度的R值應在1～0.99的范圍內[17]。

Qt=k0t

(2)

ln(Q0-Qt)=k1t+lnQ0

(3)

(4)

lnQt=nlnt+kH

(5)

(6)

(7)

式中：Qt—釋放速率，mg/h;Q0—零級釋放速率，mg/h;k0—零級釋放參數;k1—一級釋放參數;kR—Ritger-Peppas釋放參數;kH—Higuchi釋放參數;kHC—Weibull釋放參數;kBL—Baker-Lonsdale釋放參數;n—釋放參數;t—釋放時間，h。

1.6 比格犬體內藥代動力學試驗

1.6.1血樣的采集 將比格犬隨機分成3組(每組6只),比格犬在給藥前禁食12 h，但可自由飲水。將1-脫氧野尻霉素原料藥、1-脫氧野尻霉素分散體微丸和1-脫氧野尻霉素控釋微丸分別口服給藥3組比格犬。給藥后，在0.5、 1、 2、 3、 4、 6、 8、 10、 12、 18、 24和36 h分別取血5 mL。

1.6.2血漿樣品的處理 將全血樣品立即轉移到涂有抗凝血劑肝素鈉的試管中，將樣品以5 000 r/min轉速離心15 min以分離血漿，加入10 mg/Lα-萘酚異丙醇溶液200 μL混合5 min。將上層有機層轉移到試管中，并在氮氣流下在40 ℃水浴蒸發溶劑，將殘余物溶于100 μL甲醇中，取20 μL溶液注入HPLC中。

1.6.3HPLC分析 經驗證的HPLC系統用于檢測血漿中1-脫氧野尻霉素濃度[18]。使用色譜柱Sunfire C18柱(250 mm×3.5 mm，5 μm)流動相為甲醇、乙腈和水(體積比450 ∶550 ∶2.5)的混合液，柱溫35 ℃，檢測波長為215 nm，注射體積為20 μL，流速為1.0 mL/min,定量下限為28 μg/L。方法驗證結果顯示線性相關質量濃度范圍為30～850 μg/L，y=0.037 4x+0.074 3，R=0.998 7(其中，x為質量濃度，y為峰面積)。200、 400和600 μg/L的提取回收率分別為96.43%、 98.38%和97.52%。日內精密度(同一天檢測)和日間精密度(不同天檢測)的相對標準偏差均小于3.14%。

1.6.4生物利用度分析 通過WINNNONLIN 5.2版計算機軟件計算藥代動力學參數。將血漿中的1-脫氧野尻霉素質量濃度對時間作圖，得到血漿中最大質量濃度(Cmax)和最大質量濃度時間(Tmax)，計算0～36 h質量濃度-時間曲線的曲線下面積(AUC)，1-脫氧野尻霉素質量濃度下降到一半的時間(t1/2)。通過測定Cmax和Tmax值，進行α=0.05的t檢驗以確定差異的顯著性。相對生物利用度的計算公式見式(8)。相對生物利用度在80%和120%之間認為生物利用度相同，超過120%說明提高了生物利用度[19]。

Fr=AUCT×DR/AUCR×DT×100%

(8)

式中：Fr—相對生物利用度,%; AUCT—測試制劑血藥濃度-時間曲線下面積，μg·h/L;DR—參比制劑給藥劑量,mg; AUCR—參比制劑血藥濃度-時間曲線下面積,μg·h/L;DT—測試制劑給藥劑量，mg。

1.6.5體外-體內釋藥相關性 體外-體內相關性由美國食品藥物品管理局定義，是一種預測數學模型，可用于說明體內釋放和體外吸收之間的關系[20]。在該研究中，使用WINNNONLIN 5.2版計算機軟件進行體外溶出量和體內吸收量之間的線性回歸擬合,并計算R2以評估體外-體內相關性。

2 結果與分析

2.1 1-脫氧野尻霉素控釋微丸基本結構性質分析

2.1.1與輔料的相容性 根據圖1中HPLC結果分析可知，1-脫氧野尻霉素與輔料混合1個月前后其質量分數沒有變化，也無其他雜質產生, 說明1-脫氧野尻霉素與所有輔料之間沒有發生化學反應，具有良好的相容性。

2.1.2結構特征 圖2顯示了1-脫氧野尻霉素控釋微丸的掃描電子顯微鏡照片。圖2(a)和(b)展現微丸呈球形并具有連續、光滑且均勻的表面。 圖2(c)和(d)顯示微丸橫截面結構包括3層，即從內到外為1-脫氧野尻霉素層丸芯、隔離層和控釋層，每層厚度均勻，說明了制備微丸的包衣工藝穩定。

圖1 1-脫氧野尻霉素與輔料混合前(a)、后(b)的HPLC色譜圖

2.1.3物理性質 經檢測，微丸中1-脫氧野尻霉素質量占1-脫氧野尻霉素投料質量的96.7%～98.9%和異丙醇質量分數0.12%；休止角37～42°； 產率89%～94%；脆碎度(0.21±0.05)%；振實密度為(0.83±0.04) g/mL；松密度為(0.91±0.06) g/mL；水質量分數為(2.8±0.4)%；粒徑分布為600～850 μm，以上均符合中國藥典標準規定。

2.2 控釋微丸體外釋藥分析

2.2.1不同條件對體外釋藥的影響 圖3為不同處理的1-脫氧野尻霉素在不同溶出介質中的溶出曲線。由圖3可知，1-脫氧野尻霉素在4種不同的溶出介質中均呈現緩慢接近勻速地釋放，釋放過程沒有顯著差異，說明釋藥過程不受pH值影響。未放置、加速放置6個月和長期放置12個月釋放1-脫氧野尻霉素沒有顯著差異，說明控釋微丸溶出穩定性良好，適合長期存放。

質量分數2%、 4%和6%的羥丙基甲基纖維素 E50對藥物溶出的影響見圖4。由圖可知，藥物溶出不受溶出介質影響，當羥丙基甲基纖維素 E50質量分數為2%時，1-脫氧野尻霉素的溶出最快，當質量分數為6%時的溶出最慢，當其為4%時溶出速率較為理想，因為羥丙基甲基纖維素 E50為黏合劑，用量少時微丸較松散，藥物溶出較快;用量多時微丸較堅硬，藥物溶出較慢。

2.2.2體外釋藥機理探究 將藥物釋放數據應用于不同模型以闡明釋放機理，選取零級模型、一級模型、Ritger-Peppas、Higuchi、Weibull和Baker-Lonsdale釋放模型，以確定回歸方程中參數的最佳值。與各種模型參數相比，Baker-Lonsdale模型具有最佳擬合方程。如表1所示，在不同溶出介質pH 值1.2、4.0、 5.5和6.8中R值分別為0.997 7、 0.992 2、 0.990 1和0.997 3，均符合Baker-Lonsdale模型(1>R>0.99)。

pH值pH value: a.1.2; b.4.0; c.5.5; d.6.8

pH值pH value: a.1.2; b.4.0; c.5.5; d.6.8

表1 1-脫氧野尻霉素控釋微丸釋放模型以及相關系數

2.3 控釋微丸在比格犬體內藥代動力學分析

圖5 1-脫氧野尻霉素的血藥濃度-時間曲線Fig.5 Plasma concentration-time profile of 1-deoxynojirimycin matrix pellet

2.3.1藥動學數據分析 目前，尚未報道使用比格犬作為1-脫氧野尻霉素研究的動物模型，但有研究報道了使用比格犬來研究微丸在體內的藥代動力學[21]。因此，選擇比格犬進行口服給藥。在給18只健康比格犬口服40 mg 1-脫氧野尻霉素后，研究了1-脫氧野尻霉素原料藥、1-脫氧野尻霉素分散體微丸和1-脫氧野尻霉素控釋微丸的藥代動力學,結果見圖5，參數見表2。給藥1-脫氧野尻霉素原料藥后，1-脫氧野尻霉素的血漿水平非常低：Cmax為(384.79±33.64) μg/L，AUC0-t為(964.82±79.36) μg·h/L。與1-脫氧野尻霉素原料藥相比，分散體微丸顯示較高的1-脫氧野尻霉素血藥濃度水平(Cmax為(677.63±76.98) μg/L，AUC0-t為(1 797.49±126.79) μg·h/L),分別為1-脫氧野尻霉素原料的1.76倍和183.37%。 而給藥1-脫氧野尻霉素控釋微丸后Cmax在6.65 h內緩慢增加至(487.94±36.83) μg/L，之后緩慢穩定下降，AUC0-t為(2 254.83±253.54) μg·h/L。與1-脫氧野尻霉素原料藥相比，峰質量濃度和相對生物利用度分別為1.56倍和243.87%，Tmax2.34 h延長至6.65 h，t1/2為(7.82±0.74) h。1-脫氧野尻霉素原料藥和1-脫氧野尻霉素分散體微丸的t1/2分別為(3.75±0.31)和(4.43±0.62) h。延長的Tmax和t1/2表明1-脫氧野尻霉素控釋微丸中的1-脫氧野尻霉素緩慢釋放。結果表明，1-脫氧野尻霉素控釋微丸具有比1-脫氧野尻霉素分散體微丸更好的緩釋特性。延遲的Tmax有助于維持血藥濃度，從而增加了1-脫氧野尻霉素的相對生物利用度，有利于藥物的臨床應用。

表2 比格犬口服不同藥物后藥動學參數

2.3.2體外-體內相關性分析 體外-體內相關性分析是基于體外數據來預測體內的結果。對于相關性分析是將體內吸收的1-脫氧野尻霉素相對于在相同時間點體外釋放1-脫氧野尻霉素進行線性回歸分析，1-脫氧野尻霉素控釋微丸在4種pH值1.2、 4.0、 5.5和6.8溶出介質中體外溶出量與在比格犬的體內吸收量之間的線性回歸方程分別為：y=0.991 1x+0.018 9，y=0.964 7x+0.020 1，y=0.977 5x+0.010 9，y=1.001 9x-0.012 4(其中，y表示體外累積釋放速率,μg/L;x表示體內吸收,μg/L)。相關系數R2分別為0.998 2, 0.998 8, 0.994 1和0.997 6。數據表明1-脫氧野尻霉素微丸體內吸收和體外釋放在4種不同pH值溶出介質中均呈現良好的相關性。

3 結 論

3.11-脫氧野尻霉素與所有輔料之間具有良好的相容性。控釋微丸呈球形并具有連續、光滑且均勻的表面。從內到外為1-脫氧野尻霉素層丸芯、隔離層和控釋層，每層厚度均勻，說明了制備微丸的包衣工藝穩定。微丸的物理性質符合中國藥典標準規定。

3.2在4種不同的溶出介質中1-脫氧野尻霉素均呈現緩慢接近勻速地釋放，在4種介質(pH值1.2、4.0、 5.5和6.8)中釋放1-脫氧野尻霉素沒有顯著差異，說明釋藥不受pH值影響。未放置、加速放置6個月和長期放置12個月釋放1-脫氧野尻霉素沒有顯著差異，說明控釋微丸溶出穩定性良好，適合長期存放。將藥物釋放數據應用于不同模型以闡明釋放機理，結果表明，藥物釋放符合Baker-Lonsdale模型。

3.31-脫氧野尻霉素控釋微丸具有控釋特性。延遲的Tmax有助于維持血藥濃度，從而增加了1-脫氧野尻霉素的相對生物利用度，提高藥物臨床應用的適用性。

3.4體外-體內相關性分析是基于體外數據來預測體內的結果。1-脫氧野尻霉素控釋微丸在4種pH值(1.2、 4.0、 5.5和6.8)溶出介質中與在比格犬的體內吸收之間的線性回歸方程的相關系數(R2)分別為0.998 2、 0.998 8、 0.994 1和0.997 6。表明1-脫氧野尻霉素微丸體內吸收和體外釋放在4種不同pH值溶出介質中均呈現良好的相關性。