GPC3、HSP70、SALL4 和 AFP聯合表達對胃肝樣腺癌診斷的意義

于麗麗 何向蕾 吳建宇 王偉 張欣 茹國慶

胃肝樣腺癌（hepatoid adenocarcinoma of the stom－ ach，HAS）是指具有肝細胞分化特征的原發性胃癌。HAS最早在1985年由Ishikura等[1]提出，是胃癌中的一個少見亞型，具有血清甲胎蛋白（AFP）升高、容易發生肝及淋巴結轉移、預后較差的特點。但HAS是一類臨床癥狀無特異性的胃癌，以胃鏡活檢出現肝樣分化區為診斷標準。雖然手術治療及術后化療是有效的治療方法，但由于臨床上對該病的認識不足，往往因難以明確診斷而錯過最佳治療時機。血清AFP檢測可能有助于HAS的早期檢出，但不能作為診斷HAS的標準。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（glypican-3，GPC3）是肝細胞癌（HCC）的特異性標志物；熱休克蛋白70（HSP70）在多種腫瘤的發生、發展中起到重要的作用，其在HCC中具有異常表達，可以作為HCC診斷的標志物。人類婆羅雙樹樣基因-4（SALL4）是一種含鋅指結構的干細胞因子，其在肝癌組織中表達上調，是肝癌干細胞的分子標志物。目前GPC3、HSP70、SALL4、AFP 聯合檢測在 HAS 診斷中的應用尚鮮見報道，因此本文探討上述4種蛋白的聯合表達對HAS診斷的意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2009年1月至2018年4月本院經手術及病理診斷確診的HAS患者10例（同期本院胃癌手術2 493例，HAS僅占0.4%）。回顧性分析10例患者的臨床資料，參照WHO（2010）消化系統腫瘤分類及分級標準復習HE染色切片的腫瘤病理學特點，并對患者進行隨訪。

1.2 免疫組織化學檢測 采用En Vision二步法染色。嚴格按照試劑盒說明書操作，以磷酸緩沖鹽溶液（PBS）代替一抗作為陰性對照，用明確陽性組織作為陽性對照。所用一抗 GPC3、HSP70、SALL4、AFP、精氨酸酶-1（Arginase-1）、hepatocyte paraffin1（Hep Par1）、谷氨酰胺合成酶（GS）均購自北京中杉生物技術有限公司；二抗及二氨基聯苯胺（DAB）顯色劑均購自丹麥DAKO公司。

1.3 納入標準 組織學具有細胞大、胞質嗜酸、似肝細胞樣的形態特征或者原始腸樣或卵黃囊樣結構；GPC3、HSP70、SALL4、AFP免疫組化檢測至少有其中2種抗體陽性表達。

2 結果

2.1 臨床病理特征 10例患者中男9例，女1例，年齡58～75（66.0±51.7）歲。臨床癥狀有腹脹、腹痛、貧血等，均無病毒性肝炎病史及腫瘤家族史；術前AFP升高（29.1～3 260.0μg/L）7例。所有患者均行胃癌根治術，其中術前發現肝轉移1例，同時行肝腫塊切除，術后病理檢查腫瘤組織的特征見表1。病理TNM分期[2017，第8版美國癌癥聯合委員會（AJCC）]：Ⅰ期2例、Ⅱ期3例、Ⅲ期4例、Ⅳ期1例。

2.2 病理形態學特征 6例患者的腫瘤組織形態由肝樣分化區和常見的腺癌區兩部分組成；4例患者均由肝樣分化區組成。肝樣分化區與肝癌的典型組織學特征相似，癌細胞排列呈腺樣、實性片巢狀、梁狀結構，腫瘤富于血竇。癌細胞呈卵圓形或多角形，胞質豐富，呈嗜酸性，細胞核不規則，部分有多形性，核仁較明顯（圖1～3，插頁）。見廣泛脈管內癌栓（圖4，插頁）9例，淋巴結轉移7例，肝轉移1例。

2.3 免疫組化檢測結果 10例患者中7例GPC3呈胞質陽性表達（圖5，插頁），8例SALL4呈胞核陽性表達（圖6，插頁），9例HSP70呈胞質胞核陽性表達（圖7，插頁），6例AFP呈胞質陽性表達（圖8，插頁），與血清AFP升高基本一致（7/10）；6例GS呈彌漫胞質陽性表達，3例Hep Par1呈胞質顆粒狀陽性表達。Argniase-1全部陰性表達。通過上述指標組合分析發現GPC3、SALL4、HSP70和AFP的聯合表達最有意義。2個指標共同表達的有4例，3個指標共同表達的有5例，4個指標共同表達的有1例。而其余指標的組合表達未提示具有相互補充的效應（表2）。筆者也發現SALL4的表達病例中有6例組織學形態以腺管乳頭狀結構為主；AFP的表達病例中以肝樣細胞形態為主。

表1 10例HAS的臨床病理特征

表2 10例胃肝樣腺癌免疫組化表達情況

2.4 隨訪 10例患者隨訪6～60個月，4例術后出現肝轉移，8例死亡，2例健在。死亡患者平均生存期13個月。

3 討論

肝樣腺癌是一種特殊類型的腺癌，發生于肝外組織，由多角形、嗜酸性、肝細胞樣的大腫瘤細胞構成。文獻報道全身很多器官如膽囊、胃腸道等[2]都可發生肝樣腺癌，其中胃最常見[3]。胃和肝屬于胚胎發育過程中的原始前腸衍生物，由于原始潛能干細胞的分化異常，導致胃癌出現了肝癌細胞特征的分化[2]。

Inagawa等[4]研究了85例HAS患者，結果顯示HAS好發于中老年男性患者，男女比例約為2∶1，腫瘤多位于胃竇部（60.2%），腫瘤平均直徑約6.5cm，患者術前血清AFP檢測值 1.0～700 000.0μg/L，55例患者血清 AFP升高。本組患者術前血清AFP檢測升高7例，與文獻報道基本一致。與普通的胃腺癌相比，HAS侵襲性更強,預后更差[5]。本組7例淋巴結轉移，5例肝轉移（1例手術前，4例手術后復查發現），與文獻報道一致。Lin等[6]報道HAS患者中位生存時間7.2個月，5年總體生存率為20%，與普通型胃腺癌患者5年生存率存在明顯差異（20%比44%）。本組HAS患者的術后隨訪生存中位數13個月，總體生存率較普通型胃癌低，與文獻報道類似。

免疫組化檢測對HAS的診斷具有明確的指導作用，但尚未有非常明確的標志物。Su等[5]通過對53篇文獻薈萃分析發現：不同部位的肝樣腺癌中具有陽性表達的標志物可以歸納有GPC3、AFP、Hepatocyte、癌胚抗原（CEA）、各類細胞角蛋白（CK）、α1抗胰蛋白酶（α1-AT）、抗原細胞簇10（CD10）等。但各個蛋白表達的靈敏度及特異度均闡述不一，尚無明確定論。目前普遍認為，GPC3和AFP在鑒定肝細胞分化的標志物方面更具特異性。GPC3是磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族（GPC）主要成員之一，GPC蛋白通過糖基-磷脂酰肌醇復合體共同調節部分生長因子（如Wnts）的信號活動，從而對細胞的生長和分化產生重要的作用。文獻報道GPC3在HCC中具有較高的靈敏度和特異度[7]，目前也已經作為HCC常規診斷中的標志物。HSP70作為HSP家族中的主要成員在腫瘤的發生、發展中起著極其重要作用[8]。有研究認為，HSP70可以通過調節細胞分子信號傳導以及作為其他癌基因的分子伴侶促進癌癥進展[9]。研究表明HSP70作為HCC的病理診斷標志物，在HCC中的表達會隨著腫瘤的分化和病程的進展，從細胞膜表面高表達的同時逐漸在細胞質細胞核中出現表達[10]，但尚未有其在HAS中表達情況的報道。SALL4是一種具有含鋅指結構的轉錄因子，特異性表達于原始生殖細胞腫瘤如卵黃囊瘤[11]。SALL4可以促進造血干細胞分化成熟，并隨著造血干細胞的分化逐漸消失。SALL4的異常表達上調，使造血干細胞重新獲得自我更新能力，持續的改變引發多能性及惡性轉化的傾向，導致白血病的發生、發展[12]。Gonzalez-Roibon等[13]研究發現隨著腫瘤分化的降低SALL4在肝細胞癌組織中表達上調。本研究團隊通過GPC3、HSP70、SALL4、AFP、Argniase-1、Hep Par1、GS 等與肝細胞癌相關的抗體實驗以期對HAS的診斷能有提示和幫助，通過對實驗結果數據分析，發現GPC3、HSP70、SALL4和AFP在實驗組病例中至少會有2個抗體的陽性表達，所以GPC3、HSP70、SALL4和AFP聯合表達對HAS的診斷和鑒別診斷很有意義，且尚未見上述組合對肝樣腺癌的研究報道。

綜上所述。HAS是一種少見的組織學亞型，具有高侵襲性，易血管侵犯、淋巴結、肝轉移以及其他遠處轉移，預后差。本研究通過上述系列肝細胞相關抗原的免疫組化實驗，發現GPC3、HSP70、SALL4和AFP 4個抗體的免疫組化聯合檢測，結合病理形態學特征，對HAS的診斷和鑒別診斷具有重要的意義。