miR-127-5p對大鼠視網膜Müller細胞增殖能力影響的實驗研究

蔡斌 鄧剛 易全勇

miR-127-5p是miRNAs家族中的一員，與其他miRNAs一樣，可以通過靶向調控靶基因來參與多種細胞分化、增殖和凋亡的生理過程。有研究表明在開角型青光眼、白內障、糖尿病性視網膜病變等眼科疾病中miR-127-5p存在差異表達，這些研究結果預示著miR-127-5p可能在一些眼科疾病的發生中起到重要作用[1]。Müller細胞是脊椎動物視網膜的主要大膠質細胞，是視網膜最大的細胞，細胞體位于內核層，Müller細胞對于視網膜神經元的功能和代謝有支持作用，同時也負責神經膠質活化、增殖，它還能經內界膜的裂口游離至視網膜表面參與形成視網膜前膜。筆者推測miR-127-5p可能會通過調控Müller細胞增殖能力從而影響多種眼底疾病的發生、發展，因此筆者通過miR-127-5p模擬物miR-127-5p mimics轉染大鼠視網膜Müller細胞來探討這一機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 主要試劑：Müller細胞完全培養基購自無錫欣潤生物科技有限公司；鏈霉素-青霉素雙抗、OPTI-MEM培養基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶、逆轉錄試劑盒、SYBR Green PCR預混液、CCK-8檢測試劑盒均購自中國賽默飛世爾科技有限公司；基質膠原液購自上海前塵生物科技有限公司；多聚甲醛、結晶紫均購自北京科創經緯科技有限公司；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒、Propidium Iodide流式細胞儀檢測試劑盒均購自上海艾博抗貿易有限公司。細胞：大鼠視網膜Müller細胞購自上海吉瑪生物技術有限公司；miR-127-5p mimics購自上海吉瑪生物技術有限公司。

1.2 細胞培養 將大鼠視網膜Müller細胞置于Müller細胞完全培養基中培養，培養基中加入10%FBS、100U/ml的青霉素和0.1mg/ml的鏈霉素，放入37℃、含5%CO2的細胞培養箱中。取對數生長期細胞，在無菌條件下用0.25%胰酶消化，在顯微鏡下觀察到80%的細胞形態開始變圓時，取2ml細胞培養基加入細胞培養瓶中終止消化，將細胞濃度調整為5×106個/ml，備用。

1.3 分組和轉染 將培養后的大鼠視網膜Müller細胞分為實驗組和陰性對照組，其中實驗組分為3個亞組分別轉染 10、30、100μM 3 種濃度的 miR-127-5p mimics進行細胞增殖能力的檢測，陰性對照組轉染miR-127-5p陰性對照劑miR-127-5p-NC。吸取200pmol miR-127-5p mimics（對照組為miR-127-5p-NC）加入 1.5ml的無菌EP離心管中，再加入無血清培養基OPTI-MEM 1ml，充分混勻后加入轉染試劑Lipofectamine RNAiMAX 12μl，混勻后室溫靜置20min。吸取混合液緩慢滴加到Müller細胞培養板中。48h后進行后續實驗。

1.4 細胞增殖能力檢測 采用CCK-8法。將轉染后的細胞常規消化、離心、重懸后計數，將細胞接種于96孔板內，每孔細胞數2 000個，每組處理細胞設置4個復孔，放于細胞培養箱內孵育。分別于6h、第2、3、4、5天加入20%CCK-8，37°C避光孵育2h后，用酶標儀檢測450nm時的吸光度（OD）值來表示細胞增殖能力。以上實驗重復3次，取平均值。

1.5 細胞侵襲、遷移能力檢測 采用Transwell小室實驗。分為遷移小室實驗和侵襲小室實驗，前者無基質膠而后者有基質膠。取結晶紫0.05g溶于甲醇制成0.5%的結晶紫溶液，用PBS溶液1（:5～8）制成0.1%的結晶紫染液。將BD matrigel和無血清培養基以1:8比例稀釋，吸取80μl加入Trans well的上室中，放置于培養箱中至少2h。將細胞消化、離心、無血清重懸、并稀釋成5×105個/ml的細胞懸液。Transwell板中加入500μl含20%FBS的完全培養基，將小室放入板中。在Transwell小室中加入200μl的細胞懸液，將Transwell板37℃下于CO2（含量5%）培養箱中培養48h。將小室取出，用PBS洗去培養基，結晶紫染色10min；自來水將表面的結晶紫洗除干凈，用棉簽將上室中接種側的細胞擦除干凈，最后使用奧林巴斯BX51顯微鏡檢測細胞的侵襲、遷移能力，并采用Image J軟件對發生侵襲、遷移行為的大鼠視網膜Müller細胞進行計數。

1.6 細胞凋亡率檢測 采用流式細胞術。細胞懸液處理同上，取 100μl細胞懸液、5μl的 7-AAD 及 5μl的FITC Annexin V充分混勻，置于室溫（20～25℃）避光15min，加400μl Binding Buffer在1h內進行檢測，計算細胞凋亡率。

1.7 統計學處理 采用SPSS 22.0統計軟件。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度miR-127-5p mimics轉染細胞OD值的比較 與陰性對照組相比，轉染10、30、100μM miR-127-5p mimics組中大鼠視網膜Müller細胞OD值均明顯降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05），同時這3種濃度組間OD值比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 不同濃度miR-127-5p mimics轉染細胞OD值的比較

2.2 兩組細胞侵襲能力比較 陰性對照組、30μM的miR-127-5p mimics實驗組（下同）細胞侵襲數目分別為（29.19±3.42）、（14.59±2.38）個，實驗組細胞侵襲數目較陰性對照組明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖 1（插頁）。

2.3 兩組細胞遷移能力比較 實驗組、陰性對照組細胞遷移的數目分別為（29.68±3.28）、（58.19±5.42）個，實驗組細胞遷移數目較陰性對照組明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖 2（插頁）。

2.4 兩組細胞凋亡率的比較 實驗組細胞凋亡率（26.11±2.13）%，明顯高于陰性對照組的（4.19±0.76）%，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3（插頁）。

3 討論

miR-127-5p近年來被發現在多種疾病中的表達水平與正常組織比較差異均有統計學意義，同時miR-127-5p表達水平的失調也參與多種疾病的發生與發展過程[2]。研究表明miR-127-5p對于生理活動的調控主要是通過調控細胞的增殖能力，如miR-127-5p可以通過靶向結合SETD8基因調控骨肉瘤細胞系的增殖能力[3]。在骨關節炎軟骨細胞中，miR-127-5p的表達水平顯著低于正常關節軟骨組織，說明miR-127-5p過表達可以提高軟骨細胞的增殖能力[4-5]。在一系列肝癌細胞系中，miR-127-5p的表達水平顯著高于正常細胞系，而在乳腺癌細胞中miR-127-5p的表達水平顯著下調[2]。在眼科類疾病中同樣也發現miR-127-5p具有表達水平差異，例如在視網膜發育過程中發現的一系列具有表達差異的miRNAs中就有miR-127-5p的存在，在開角型青光眼與白內障患者中發現的16種具有差異表達的miRNAs中也包含miR-127-5p[6]，在糖尿病引起的視網膜病變組織中，存在17種差異表達的miRNAs，而miR-127-5p也正是差異表達的miRNAs中的一員[7]。

根據文獻報道可知，miRNAs在目標組織的異常表達通常暗示著該miRNAs在該組織中可能存在調控作用[2]。在本實驗中筆者選用大鼠視網膜Müller細胞為研究對象，Müller細胞是視網膜中非常重要的一類膠質細胞，Müller細胞不僅在正常的視網膜功能中有重要作用，在各類型的視網膜變性疾病中Müller細胞同樣具有重要作用[8]，同時在特發性黃斑前膜的形成過程中，視網膜Müller細胞發揮重要作用，研究表明在大多數特發性黃斑前膜組織中都具有谷氨酰胺合成酶免疫反應性，這表明特發性黃斑前膜的組成細胞可能主要起源于Müller細胞，因為谷氨酰胺合成酶的免疫反應性主要表達在Müller細胞中[9-10]。此外，轉化生長因子β可以通過調控視網膜Müller細胞的增殖、遷移和轉化參與特發性黃斑前膜的形成[11]。這些研究證據充分證明Müller細胞的活性在特發性黃斑前膜的發生、發展中具有重要作用，因此為了探究miR-127-5p表達水平顯著下調在特發性黃斑前膜中的作用，筆者使用Müller細胞作為研究模型，通過細胞增殖、細胞侵襲、細胞遷移以及細胞凋亡實驗以探究miR-127-5p對于Müller細胞行為的影響。

本研究采用 10、30、100μM 的 miR-127-5p mimics轉染大鼠視網膜Müller細胞，并檢測這3種濃度的miR-127-5p mimics對于大鼠視網膜Müller細胞的增殖能力的影響，結果顯示miR-127-5p mimics轉染后可以顯著抑制大鼠視網膜Müller細胞的增殖能力，該結果與miR-127-5p在其他細胞中對于細胞增殖能力的調控作用一致，如在肝癌細胞系中，miR-127-5p可以通過靶向結合BLVRB基因抑制其表達水平從而抑制肝癌細胞系的增殖能力，在乳腺癌細胞中，miR-127-5p可以通過抑制靶基因BCL6表達水平從而抑制乳腺癌細胞的增殖能力[7]。此外，筆者還進一步檢測了miR-127-5p表達水平升高后對于大鼠視網膜Müller細胞的其他細胞行為的影響。根據實驗結果發現，miR-127-5p表達水平升高之后，大鼠視網膜Müller細胞的侵襲能力和遷移能力均受到顯著抑制，該結果同樣與miR-127-5p在其他細胞侵襲和遷移中的作用類似[7]，證明miR-127-5p表達水平升高能抑制大鼠視網膜Müller細胞的增殖能力。此外，筆者采用流式細胞術檢測凋亡結果發現，miR-127-5p表達水平升高后，大鼠視網膜Müller細胞凋亡率增加，證明miR-127-5p表達水平升高不僅能抑制大鼠視網膜Müller細胞的增殖能力，同時還在一定程度上促進了視網膜Müller細胞的凋亡。

總之，本研究證實了miR-127-5p表達水平升高可以抑制大鼠視網膜Müller細胞增殖、侵襲和遷移能力，并促進視網膜Müller細胞的凋亡。miR-127-5p可能是治療或者阻止特發性黃斑前膜發展的潛在靶點。