多囊卵巢綜合征患者血清特異性LncRNA表達譜研究

吳鑌莎 余寧 盧佳敏 李小青 周怡池 萬凌屹 謝遲遲 張娟文 鄭若姮

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是一種以持續排卵障礙、高雄激素血癥及胰島素抵抗（insulin resistance，IR）為特征的生殖內分泌常見疾病，其發病率在育齡期婦女中達5%～10%，占不排卵性不孕癥的50%～70%[1]。PCOS以不孕、多毛、無排卵及月經不調等為主要臨床表現，同時伴有特征性的血清生化指標改變，如雄激素及促黃體激素（luteinizing hormone，LH）水平上升但卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）水平正常等。PCOS是一種多因性疾病，與遺傳[2]、基因多態性[3]、代謝綜合征[4]及環境[5]等因素密切相關，但具體機制仍然未明，且缺少特異性的分子生物學診斷標志物。本研究聯合長鏈非編碼核糖核酸（long noncoding ribonucleic acid，LncRNA）表達芯片初篩及實時定量逆轉錄-聚合酶鏈反應（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）驗證，構建 PCOS特異性表達譜，進一步采用生物信息學方法推測其可能的下游基因通路，為PCOS分子生物學診斷方法的研發提供新思路。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2017年1月1日至2018年6月30日在浙江大學醫學院附屬第一醫院就診的50例PCOS患者為PCOS組，同期在體檢中心常規體檢的50例健康人群作為對照。PCOS的診斷依據鹿特丹標準（至少滿足以下3條標準中的2條）：（1）排卵減少或不排卵；（2）臨床雄激素過高征，包括多毛、痤瘡、男性化的脫發以及高雄激素血癥；（3）B超檢查見一側或雙側卵巢直徑2～9mm的卵泡≥12個和(或)卵巢體積≥10cm3。本研究經醫院倫理委員會審查批準，兩組對象均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 血清RNA提取 采集所有對象血清5ml，-80℃保存備用。每例取血清 100～500μl，加入 800μl Trizol-LS，振蕩混勻；加入 10μl 0.1pmol/μl的 miRNA156，振蕩混勻，靜置15min。加入200μl氯仿，劇烈振蕩，靜置15min；16 000g離心20min。取上清液，加入400μl水飽和酚，振蕩混勻，靜置1～2min；16 000g離心3min。取上清液，加入200μl水飽和酚和200μl氯仿，振蕩混勻，靜置1～2min；16 000g離心 3min。取上清液（約 800μl），分至兩管，每管加入1ml異丙醇，振蕩混勻，靜置于冰上20min；4℃、16 000g離心20min。棄上清液，每管加入500μl 75%焦碳酸二乙酯（DEPC）-乙醇，振蕩后16 000g離心20min。棄上清液，用吸水紙在試管口將剩余液體吸干，開蓋晾干（若液體仍較多，可用移液槍將液體吸出，但應注意不要碰到管底）。每管加入15μl DEPC水，靜置待RNA溶解后，將兩管合并。

1.2.2 LncRNA表達譜檢測 從PCOS組、對照組分別隨機選取3例血清標本進行LncRNA表達譜檢測。使用Nanodrop測定提取RNA在分光光度計260、280、230nm處的吸光度，以進行濃度測定與純度評估。用甲醛電泳試劑進行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA純度及完整性。采用人類8*60KLncRNA芯片進行信號采集，該芯片包含有30 586個人LncRNA位點（Arraystar，Rockville，Maryland，USA）。首先根據單色微陣列基因表達分析流程（Agilent Technology，Santa Clara，USA）進行樣本的標記與序列雜交，再利用安捷倫圖像獲取軟件11.0.1.1進行圖像分析。后續的分位數標準化與數據處理在GeneSpring GX v12.1軟件（Agilent Technologies）中進行。聯合分析組間t檢驗（P＜0.05）、多重假設檢驗（FDR＜0.05）和倍數變化（＞2或＜0.5）的結果，得到顯著性差異的LncRNA表達譜。進一步以熱圖形象化顯示可區分PCOS患者和健康人群的差異表達LncRNA。

1.2.3 LncRNA的qRT-PCR驗證 選取包含接受芯片檢查對象在內的PCOS患者和健康人群各6例，使用Prime Script RTreagent試劑盒（TakaRa，大連，中國）針對熱圖得到的差異表達LncRNA進行qRT-PCR驗證。U6核小RNA（snRNA）進一步擴增，作為內參。將每個LncRNA的絕對表達量除以U6 snRNA的絕對表達量，得到LncRNA的相對表達量。

1.2.4 生物信息學分析 將芯片得到的顯著上調和下調的LncRNA，利用starbase網站（http://starbase.Sysu.edu.cn）進行下游調控靶基因預測。將預測得到的信使RNA（mRNA）進行基因本體注釋（gene ontology，GO）富集分析，以得到潛在的共同細胞生物學功能。

1.3 統計學處理 采用SPSS 11.0統計軟件。每項實驗至少進行3次，正態分布的計量資料用±s表示，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組對象一般資料比較 與對照組相比，PCOS組體重指數（body mass index，BMI）、睪酮、甘油三酯、C 反應蛋白（C-reactive protein，CRP）水平及胰島素抵抗穩態模型（homeostasis model assessment-insulin resistance，HOMA-IR）明顯增高，雌二醇水平明顯降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；兩組對象年齡、膽固醇水平比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表1。

2.2 PCOS患者LncRNA表達譜的構建 與對照組比較，PCOS組患者血清中分別有351、217種顯著上調和下調的LncRNA（符合變化系數≥2.0，P＜0.05）。進一步作聚類分析，發現包含顯著上調的11種LncRNA和顯著下調的8種LncRNA的數據集可以成功區分PCOS患者和健康人群，見圖1（插頁）。

2.3 差異表達LncRNA的驗證 通過qRT-PCR驗證熱圖中所列LncRNA，與對照組比較，在PCOS組上調的LncRNA中，ENST00000433673和 CTC-338M123未達到顯著性差異；在PCOS組下調的LncRNA中，ENST00000569039未達到顯著性差異。qRT-PCR結果進一步支持LncRNA芯片作為初篩方法的靈敏度和特異度。

表1 兩組對象一般資料比較

2.4 LncRNA下游靶基因的GO富集分析 選取PCOS患者LncRNA芯片中顯著上調和下調的LncRNA各20個，輸入Starbase網站進行下游基因預測，得到的靶基因作進一步GO富集分析，結果發現顯著上調LncRNA預測的mRNA共涉及11個相關GO生物學功能，包括細胞生長和體積的負調控、N-乙酰葡萄胺/葡萄胺代謝過程、氨基糖代謝過程、細胞組分大小和定位調控、細胞腔；顯著下調LncRNA預測的mRNA共涉及20個相關GO生物學功能，包括基因及表觀遺傳學負調控、細胞活化調控、細胞周期、淋巴血管發育、鈣離子反應、染色質重塑、離子轉運、干擾素r生物合成過程正調控、血細胞發生、嘌呤堿生物合成、結合調控、mRNA接合位點選擇、細胞運動、轉錄、白細胞活化調控，見圖2。

圖2 差異表達LncRNA所預測靶基因的GO富集分析（a：顯著上調LncRNA所預測的下游mRNA；b：顯著下調的LncRNA所預測的下游mRNA）

3 討論

當前PCOS的診斷多采用2003年鹿特丹標準[6]。各項研究表明 PCOS除引起生殖功能和代謝功能的異常外，還可增加子宮內膜癌、血脂異常、心血管疾病和2型糖尿病的發病風險。有報道指出，PCOS可并發雄激素性脫發、睡眠呼吸暫停、抑郁、妊娠期高血壓、先兆子癇、非酒精性脂肪性肝病等[7]，病情嚴重時可能影響女性一生的健康。由此可見，早期診斷和治療是至關重要的。因此，構建PCOS非侵入性的分子標志物群，不僅有助于提高疾病的臨床檢出率，實現早期診療，對于PCOS的研究、減輕社會經濟負擔也有重要意義。

LncRNA是一類長度介于200～100 000個核苷酸的非編碼RNA[8]。目前研究認為，它在表觀遺傳學水平、轉錄水平及轉錄后水平上廣泛地參與腫瘤調節基因的表達，從而在復雜的腫瘤調控網絡中發揮重要作用[9]。此外，LncRNA通過調控下游靶基因參與各種病理、生理過程（如腫瘤發生、信號轉導、血管生成等）也是當前學術界研究的熱點。然而，LncRNA在PCOS中的研究并不多見，且主要集中于其下游調控機制的研究（如LncRNA-GS5促進PCOS患者的IR[10]、LncRNA介導的內源競爭RNA網絡在PCOS患者卵母細胞核成熟中的作用[11]）或組織LncRNA表達譜的變化（如PCOS患者顆粒細胞[12]和卵丘細胞[13]）。

血清存在著多種蛋白、糖質、色素、電解質、無機鹽，同時還匯集了來自全身組織器官的多種信號分子。目前組織中LncRNA分子已被證實是一類新型疾病標志物，而血清中LncRNA是否存在同樣的效能，是當前研究的最熱點問題之一。Chen等[14]最早闡明了血清中存在穩定的miRNA（一種短鏈RNA）并且在不同疾病之間miRNA的表達譜存在有顯著性差異，支持血清中非編碼RNA存在的可能。此后，血清LncRNA在食管鱗癌[15]、膀胱癌[16]和乳腺癌[17]中的預測作用陸續被發現，使得血清LncRNA表達譜在疾病中的作用日益受到重視。血清LncRNA作為新型疾病標志物，具有檢出譜系廣、靈敏度高、檢測成本低、取材方便、樣本易存放（-20℃存放即可）等優點，該方法可廣泛用于疾病普查等相關工作，成為了早期診斷疾病的有效手段。但是筆者檢索了國內外文獻，關于血清LncRNA在PCOS中的研究未見報道。

本研究通過LncRNA表達譜研究，闡明了PCOS患者差異性表達的LncRNA；并進一步作聚類分析，發現包含顯著上調的11種LncRNA和顯著下調的8種LncRNA的數據集可以成功區分PCOS患者和健康人群。針對聚類分析的結果，進一步采用qRT-PCR進行驗證，發現16種LncRNA差異表達與芯片結果一致，符合率達84.2%。在這些差異表達的LncRNA中，既往研究提示CCAT1與腫瘤發生、發展密切相關，如其通過介導下游Runx2基因參與人宮頸癌的增殖和上皮細胞向間質細胞的轉變[18]；XLOC家族中的006390被報道可以通過穩定c-Myc來促進胰腺癌發生和谷氨酸鹽代謝[19]；LncRNA-ROR可以通過調節miRNA-145/FSCN1通路促進食管癌細胞的轉移和浸潤[20]。生物信息學分析結果提示，這些差異表達的LncRNA下游調控基因的生物學功能涵蓋細胞生長、活化、表觀遺傳學調控等，值得進一步研究。

綜上所述，本研究系統闡述了PCOS患者血清特異性LncRNA表達譜，并對熱圖分析產生的差異LncRNA進行qRT-PCR驗證，進一步對預測的下游mRNA進行生物信息學分析，通過GO富集分析找到若干關鍵基因功能，為PCOS非侵入性診斷提供分子生物學標志物。但本研究也存在一些不足：（1）PCOS患者血清LncRNA表達譜測定的樣本數偏少，雖經qRT-PCR驗證，但仍可能會發生較大偏倚，無法充分反映目標人群情況；（2）筆者預測了差異表達程度最高的20個LncRNA的下游mRNA，但仍需要進一步qRT-PCR驗證，同時擴大驗證進行預測下游mRNA的LncRNA范圍；（3）僅采用GO富集分析LncRNA下游mRNA的生物信息學功能，后續可針對其KEGG通路作進一步分析。