高效液相色譜在中藥分析中的應(yīng)用研究進(jìn)展

楊貴金 韋雅樓 秦青青 吳曉燕 王煒

摘要：本文簡要介紹高效液相色譜技術(shù)的歷史發(fā)展，對幾種常見的高效液相色譜和近期發(fā)展起來的一些新型高效液相色譜的研究進(jìn)展、應(yīng)用及前景進(jìn)行綜述。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜;中藥分析;應(yīng)用研究

色譜法是利用混合物中各組分在兩相中分配系數(shù)不同，當(dāng)流動相推動樣品中的組分通過固定相時(shí)，在兩相中進(jìn)行連續(xù)反復(fù)多次分配，從而形成差速移動，達(dá)到分離的方法[1-3]。根據(jù)流動相的狀態(tài)可分為氣相色譜法和液相色譜法。在液相色譜中，采用顆粒十分細(xì)的高效固定相并采用高壓泵輸送流動相，全部工作通過儀器來完成。這種色譜稱為高效液相色譜（HPLC）。20 世紀(jì)60 年代后期，由于新型柱填料高壓輸液泵和高靈敏度檢測器的出現(xiàn)，才使液相色譜快速發(fā)展起來，并發(fā)展成為高效液相色譜。本文簡要介紹高效液相色譜技術(shù)的歷史發(fā)展，對幾種常見的高效液相色譜和近期發(fā)展起來的一些新型高效液相色譜的研究進(jìn)展、應(yīng)用及前景進(jìn)行綜述。

1 高效液相色譜的歷史發(fā)展

1903年，M.S.Tswett 發(fā)表了題為“一種新型吸附現(xiàn)象及在生化分析上的應(yīng)用”的研究論文，文中第一次提出了應(yīng)用吸附原理分離植物色素的新方法。1906 年，他命名這種方法為色譜法。這種簡易的分離技術(shù)，奠定了傳統(tǒng)色譜法基礎(chǔ)。高效液相色譜的發(fā)展始于20世紀(jì)60年代中后期。60年代末科克蘭、哈伯、荷瓦斯、莆黑斯、里普斯克等人開發(fā)了世界上第一臺高效液相色譜儀，開啟了高效液相色譜的時(shí)代。1971年科克蘭等人出版了《液相色譜的現(xiàn)代實(shí)踐》一書，標(biāo)志著高效液相色譜法正式建立。1975 年Small發(fā)明了以離子交換劑為固定相、強(qiáng)電解質(zhì)為流動相，采用抑制型電導(dǎo)檢測的新型離子色譜法。在此后的時(shí)間里，高效液相色譜成為最為常用的分離和檢測手段，在有機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥物學(xué)與檢測、化工、食品科學(xué)、環(huán)境監(jiān)測、商檢和法檢等方面都有廣泛的應(yīng)用。

2 幾種常見高效液相色譜

根據(jù)分離機(jī)制不同，高效液相色譜可分四大基礎(chǔ)類型：分配色譜、吸附色譜、離子交換色譜、凝膠色譜。

2.1 分配色譜法

分配色譜法是四種液相色譜法中應(yīng)用最廣泛的一種。它類似于溶劑萃取，溶質(zhì)分子在兩種不相混溶的液相即固定相和流動相之間按照它們的相對溶解度進(jìn)行分配。一般將分配色譜法分為液液色譜和鍵合相色譜兩類。液液色譜的固定相是通過物理吸附的方法將液相固定相涂于載體表面。在液液色譜中，為了盡量減少固定相的流失，選擇的流動相應(yīng)與固定相的極性差別很大。

鍵合相色譜的固定相是通過化學(xué)反應(yīng)將有機(jī)分子鍵合在載體或硅膠表面上。目前，鍵合固定相一般采用硅膠為基體，利用硅膠表面的硅醇基于有機(jī)分子之間成鍵，即可得到各種性能的固定相。一般來說，鍵合的有機(jī)基團(tuán)主要有兩類：疏水基團(tuán)、極性基團(tuán)。疏水基團(tuán)有不同鏈長的烷烴（C8和C18）和苯基等。極性基團(tuán)有丙胺基、氰乙基、二醇、氨基等。與液液色譜類似，鍵合相色譜也分為正相鍵合相色譜和反相鍵合相色譜。

2.2 吸附色譜法

吸附色譜又稱液固色譜，固定相為固體吸附劑。這些固體吸附劑一般是一些多孔的固體顆粒物質(zhì)，在它的表面上通常存在吸附點(diǎn)。因此吸附色譜是根據(jù)物質(zhì)在固定相上的吸附作用不同來進(jìn)行分離的。常用的吸附劑有氧化鋁、硅膠、聚酰胺等有吸附活性的物質(zhì)，其中硅膠應(yīng)用最為普遍。吸附色譜具有操作簡便等優(yōu)點(diǎn)。一般來說液固色譜最適于分離那些溶解在非極性溶劑中、具有中等相對分子質(zhì)量且為非離子性的試樣。此外，液固色譜還特別適于分離色譜幾何異構(gòu)體。

2.3 離子交換色譜法

離子交換色譜是利用被分離物質(zhì)在離子交換樹脂上的離子交換勢不同而使組分分離。一般常用的離子交換劑的基質(zhì)有三大類：合成樹脂、纖維素和硅膠。作為離子交換劑的有陰離子交換劑和陽離子交換劑。流動相一般為水或含有有機(jī)溶劑的緩沖液。離子交換色譜特別適于分離離子化合物、有機(jī)酸和有機(jī)堿等能電離的化合物和能與離子基團(tuán)相互作用的化合物。它不僅廣泛應(yīng)用于有機(jī)物質(zhì)，而且廣泛地應(yīng)用于生物物質(zhì)的分離，如氨基酸、核酸蛋白質(zhì)、維生素等。

2.4 凝膠色譜法

凝膠色譜又稱尺寸排斥色譜。與其他液相色譜方法不同，它是基于試樣分子的尺寸大小和形狀不同來實(shí)現(xiàn)分離的。凝膠的空穴大小與被分離的試樣的大小相當(dāng)。太大的分子由于不能進(jìn)入空穴，被排除在之外，隨流動相先流出。小分子則進(jìn)入空穴，與大分子所走的路徑不同，最后流出來。中等分子處于兩者之間。常用的填料有瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺。流動相可根據(jù)載體和試樣的性質(zhì)，選用水或有機(jī)溶劑。凝膠色譜分辨力高，不會引起變性，可用于分離相對分子量高的（大于2000）的化合物，但其不適于分離相對分子質(zhì)量相似的試樣。

從應(yīng)用的角度講，以上四種基本類型的色譜法實(shí)際上是相互補(bǔ)充的。對于相對分子質(zhì)量大于10000的物質(zhì)的分離主要適合選用凝膠色譜;低相對分子質(zhì)量的離子化合物的分離較適合選用離子交換色譜;對于極性小的非離子化合物最適用分配色譜;而對于要分離非極性物質(zhì)、結(jié)構(gòu)異構(gòu)，以及從脂肪醇中分離脂肪族氫化合物等最好要選用吸附色譜。

3 新型高效液相色譜

高效液相色譜作為物質(zhì)分離的重要工具，在各個(gè)方面都取得了很大的發(fā)展，出現(xiàn)了許多的新型色譜。在分配機(jī)制方面，親和色譜則根據(jù)另一類分配機(jī)制而進(jìn)行分離的新型色譜。它是利用生物大分子與其相應(yīng)互補(bǔ)體間特異識別能力進(jìn)行多次差別分離的一種色譜。其具有選擇性高、操作條件溫和的特點(diǎn)。在流動相方面，超臨界流體色譜以超臨界流體為流動相?；旌衔镌诔R界流體色譜上的分離機(jī)理與氣相色譜及液相色譜一樣，即基于各化合物在兩間的分配系數(shù)不同而得到分離。超臨界流體色譜融合了氣相色譜和液相色譜的一些特征，具有比氣相色譜和液相色譜更廣泛應(yīng)用范圍。在固定相方面，高分子手性固定相實(shí)現(xiàn)了手性藥物的 分離。

4 高效液相色譜在中藥分析中的應(yīng)用前景

中藥研究的大趨勢是全成分分析，通過對從單味藥到復(fù)方的不同配伍、煎煮時(shí)間等的研究，才能發(fā)現(xiàn)中藥中化學(xué)成分的變化規(guī)律，找到中藥機(jī)理之間的有機(jī)聯(lián)系。中藥成分繁多，且各種成分的性質(zhì)遍布所有極性段、酸堿范圍。實(shí)現(xiàn)多成分分析的最簡單途徑即在一根足夠長的色譜柱上，采用溫和的流動相，在足夠長的時(shí)間內(nèi)洗脫。但這與現(xiàn)代分析要求的簡便快速相悖。通過大量的應(yīng)用研究表明，高效毛細(xì)管電泳在分析中藥成分，尤其在分析高極性化學(xué)成分方面有較大優(yōu)勢，在分析大量的復(fù)方制劑方面顯示了較高的能力。由于毛細(xì)管幾乎不會出現(xiàn)高效液相色譜分析中常出現(xiàn)的柱床污染現(xiàn)象，而且用過的毛細(xì)管柱只需很短的時(shí)間進(jìn)行沖洗后，即可以進(jìn)行第二個(gè)樣品的分析，快速高效且分辨率很高。

參考文獻(xiàn)：

[1]屠鵬飛.高效液相色譜法制定中藥材和中藥注射劑特征指紋圖譜的探討[J].中成藥，2000，022（007）：516-516.

[2]于世林.高效液相色譜方法及應(yīng)用[J].核化學(xué)與放射化學(xué)，2005，27（3）：163-163.

[3]鄭玉果，姚新生.高效液相色譜在黃酮類化合物分析中的應(yīng)用[J].中草藥，1994（10）：542-545.