自體骨髓單核細(xì)胞移植對兔退行性病變后椎間盤的修復(fù)作用

崔基浩 李創(chuàng) 馬文斌 李春 徐萬宏

腰椎間盤退行性病變是臨床常見疾病，嚴(yán)重影響患者的日常生活及工作[1]。椎間盤是由軟骨終板、纖維環(huán)及中間的髓核組成，正常的髓核細(xì)胞通過分泌各種生長因子維持細(xì)胞外基質(zhì)的合成與分解代謝的動(dòng)態(tài)平衡。在衰老、創(chuàng)傷、遺傳、生活方式等因素作用下，髓核細(xì)胞數(shù)量逐漸減少、功能減退，使其調(diào)節(jié)胞外基質(zhì)的代謝平衡被打破，導(dǎo)致椎間盤退行性病變：蛋白多糖、Ⅱ型膠原合成逐漸減少，髓核組織滲透壓下降、水分丟失、椎間隙變窄、脊柱生物力學(xué)發(fā)生改變[2]。臨床表現(xiàn)為腰痛、椎間隙高度丟失及MRI T2W1加權(quán)像高信號消失等特征。已有的藥物及物理治療雖可延緩病程、改善部分癥狀，但無法逆轉(zhuǎn)疾病過程。手術(shù)治療包括椎間盤摘除、椎板切除椎管減壓、椎體間融合、人工椎間盤等[3]，均以破壞椎間盤的正常生理、解剖結(jié)構(gòu)為代價(jià)，不能從根本上治愈椎間盤的退行性病變。骨髓單核細(xì)胞(Bone marrow mononuclear cells，BMMNC)是由包括間充質(zhì)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、造血祖細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和血小板在內(nèi)的異質(zhì)性細(xì)胞群組成[4]，可產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子和營養(yǎng)因子，能夠激活體內(nèi)的內(nèi)源性修復(fù)反應(yīng)[5]。本研究將自體骨髓單核細(xì)胞注入兔退行性病變的椎間盤，利用影像學(xué)及組織學(xué)方法，觀察髓核含水量、椎間隙高度的維持及細(xì)胞形態(tài)、胞外基質(zhì)含量，探討自體骨髓單核細(xì)胞對退行性病變后椎間盤的修復(fù)作用，以期為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

新西蘭大白兔12只，3月齡，體質(zhì)量約2.5～3.0 Kg，雌雄不限，隨機(jī)分為對照組(n=6)和治療組(n=6)。

1.2 研究方法

1.2.1 提取自體骨髓單核細(xì)胞

治療組實(shí)驗(yàn)兔髂后上棘處穿刺，抽取骨髓(約1～2 mL)，與Hank's平衡鹽溶液1∶1混合，1 000 r/min離心30 min，按梯度界面回收單核細(xì)胞層，然后用生理鹽水配置成細(xì)胞密度為5×105cells/mL的細(xì)胞懸液，標(biāo)記待用。

1.2.2 椎間盤穿刺造模

兩組實(shí)驗(yàn)兔麻醉后，暴露L4/5、L5/6、L6/7椎間隙，使用16 G穿刺針沿椎間盤左側(cè)刺入，見膠凍樣髓核溢出即為造模成功。對照組直接縫合關(guān)閉傷口。治療組使用22 G針頭自椎間盤前方穿刺注入制備的BMMNCs懸液約0.3 mL，然后縫合關(guān)閉傷口。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 椎間盤高度指數(shù)觀察

兩組分別在術(shù)后第1天和第4、8、24周時(shí)行腰椎側(cè)位X線攝片，使用影像軟件系統(tǒng)進(jìn)行測量并計(jì)算椎間盤高度指數(shù)(Disc height index，DHI)。DHI=椎間盤高度/上位椎體高度×100%。

1.3.2 椎間盤MRI觀察

兩組分別在術(shù)后第4、8、24周進(jìn)行MR T2W1加權(quán)像掃描，并以正常椎間盤MR T2W1加權(quán)像掃描為空白對照。

1.3.3 椎間盤組織學(xué)觀察

兩組分別在術(shù)后第4、8、24周完成影像學(xué)檢查后，取L4/5、L5/6、L6/7椎間盤組織行固定、包埋、切片及HE染色，并以正常椎間盤作為空白對照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 椎間盤高度指數(shù)觀察對比

兩組在術(shù)后第1天和第4、8、24周分別進(jìn)行腰椎側(cè)位X線攝片，并計(jì)算DHI。結(jié)果顯示，對照組的DHI均值分別為9.00%、7.15%、5.73%和4.18%，而治療組的DHI均值分別為9.10%、8.75%、8.70%、7.35%。治療組在阻止椎間隙高度丟失方面明顯優(yōu)于對照組(P<0.05)(圖1)。

圖1 各組各時(shí)間點(diǎn)椎間盤高度指數(shù)(DHI)Fig. 1 DHI in each group at different time points

2.2 椎間盤MR觀察對比

MR T2W1加權(quán)像掃描結(jié)果顯示，術(shù)后第4、8、24周時(shí)治療組椎間盤MR T2W1加權(quán)像信號始終高于對照組(P<0.05)，與正常椎間盤相近，說明治療組椎間盤含水量的維持明顯優(yōu)于對照組。此外，還觀察到對照組的椎間隙變窄趨勢較治療組明顯(圖2)。

圖2 術(shù)后第8周各組椎間盤MR T2W1加權(quán)像Fig. 2 MR T2W1 weighted images of intervertebral discs in each group at the 8th week of postoperation

2.3 組織學(xué)觀察

組織學(xué)觀察顯示，正常髓核組織為有序的細(xì)胞外基質(zhì)排列、分布均勻的橢圓形髓核細(xì)胞。治療組的髓核細(xì)胞數(shù)量與正常髓核相比相對減少，但排列規(guī)整，呈橢圓透明狀，胞外基質(zhì)均勻。對照組的髓核細(xì)胞數(shù)量更加減少，分布零散、混亂，呈梭形及不規(guī)則形，體積變小甚至消失不見，胞外基質(zhì)收縮、不均(圖3)。

圖3 各組各時(shí)間點(diǎn)椎間盤組織學(xué)觀察Fig. 3 Histological observation of intervertebral disc in each group at different time points

3 討論

椎間盤退行性病變臨床較為常見，保守治療僅可延緩疾病進(jìn)程、緩解部分癥狀；手術(shù)治療均會破壞椎間盤的正常生理、解剖結(jié)構(gòu)，且無法恢復(fù)正常的生理功能。目前研究表明，椎間盤內(nèi)髓核細(xì)胞數(shù)量的減少及功能減退引起胞外基質(zhì)蛋白含量下降是導(dǎo)致椎間盤退變的主要原因，這些病理改變會引起椎間盤組織含水量降低、滲透壓下降、營養(yǎng)通道關(guān)閉，進(jìn)一步加劇疾病進(jìn)程，最終引起脊柱的生物力學(xué)改變，產(chǎn)生腰痛、下肢放射麻痛、間歇性跛行、馬尾綜合征等一系列臨床癥狀[6]。因此，為了減緩甚至逆轉(zhuǎn)椎間盤的退變過程，恢復(fù)椎間盤的正常結(jié)構(gòu)功能，可以通過移植具有類髓核細(xì)胞功能的外源細(xì)胞或者激活原有的髓核細(xì)胞功能，促使蛋白多糖及Ⅱ型膠原等胞外基質(zhì)的合成，從而達(dá)到修復(fù)退變椎間盤的目的。近年來，在椎間盤退變的再生醫(yī)學(xué)研究中，間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)移植備受關(guān)注。MSCs是多能性細(xì)胞，具有很強(qiáng)的增殖、分化能力，且易從各種組織來源中獲得[7]。Deschepper等[8]證實(shí)，MSCs治療退變椎間盤具有一定的效果，表現(xiàn)為椎間盤高度增加、MRI T2W1加權(quán)信號增強(qiáng)、組織學(xué)分級改善、細(xì)胞外基質(zhì)含量和相關(guān)基因表達(dá)的恢復(fù)等。然而，該方法目前尚存在一些問題，無法應(yīng)用于臨床。因此，我們認(rèn)為選擇一種具有與MSCs類似的再生作用，不需要體外擴(kuò)增、易獲取及利于臨床轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是解決上述問題的可能的途徑。

BMMNCs由包含MSCs、造血干細(xì)胞、造血祖細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和血小板在內(nèi)的異質(zhì)性細(xì)胞群組成，對骨關(guān)節(jié)炎[9]、脊髓損傷[10]、缺血性腦損傷[11]等疾病具有治療作用；另外，BMMNCs的快速收集、移植等操作允許在手術(shù)室中完成，且無需體外培養(yǎng)[12]，從而降低了成本和污染風(fēng)險(xiǎn)。BMMNCs是一種比較理想的，有望用于修復(fù)椎間盤退變的外源性移植細(xì)胞。

當(dāng)椎間盤發(fā)生退變時(shí)，其髓核細(xì)胞凋亡，細(xì)胞數(shù)量減少，胞外基質(zhì)降解加快，蛋白多糖及Ⅱ型膠原含量減少[13]；組織親水能力明顯下降，使椎間盤含水量顯著降低，椎間隙高度逐漸變窄。椎間盤退變時(shí)X線表現(xiàn)為椎間隙變窄、邊緣骨贅形成和脊柱曲線改變，其中椎間隙高度變窄為最具特征性的改變。本研究中，兩組術(shù)后的X線檢查結(jié)果顯示，治療組椎間盤的退變得到顯著減緩。

通過對椎間盤進(jìn)行MR T2W1加權(quán)像掃描，評估其信號的強(qiáng)弱，反映出椎間盤的含水量變化及具有親水性帶電荷的蛋白多糖的含量，是評價(jià)椎間盤退變的一個(gè)重要指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，治療組椎間盤MR T2W1加權(quán)像信號始終高于對照組，且較接近正常椎間盤的信號強(qiáng)度，說明本實(shí)驗(yàn)中治療組椎間盤含水量的維持明顯優(yōu)于對照組，證明治療組椎間盤的退變過程被延緩或中止，椎間盤得到一定修復(fù)。

椎間盤退變時(shí)其組織學(xué)層面的細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)都會發(fā)生一定的病理變化，組織學(xué)染色觀察也是公認(rèn)最準(zhǔn)確的評價(jià)退變的方法[14]。本研究結(jié)果顯示，在髓核細(xì)胞形態(tài)、胞外基質(zhì)分布及細(xì)胞數(shù)量方面，治療組明顯優(yōu)于對照組，與正常椎間盤接近，也同樣說明了治療組椎間盤的退變得到有效減緩。

綜上所述，自體骨髓單核細(xì)胞對退變的椎間盤具有一定的修復(fù)再生作用，具有潛在的應(yīng)用前景，值得進(jìn)一步深入研究。