枸杞甜菜堿檢測(cè)方法及提取工藝的優(yōu)化

史蓉，李婷婷，王蓉，周麗

酒泉市食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心（酒泉 735000）

枸杞（Lycium barbarum）是茄目茄科枸杞屬植物，是名貴的中藥材和保健品[1]。枸杞口感微甜，含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，具有補(bǔ)腎生精，養(yǎng)肝，明目安神，降血脂，抗氧化等方面的功效[2]，被廣泛用于功能性食品的研究與開發(fā)，在我國(guó)的食品、保健品和醫(yī)藥業(yè)方面占據(jù)了重要地位。

甜菜堿（Betaine）是一種季胺型生物堿，學(xué)名三甲基胺乙內(nèi)酯，作為一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)在高等植物體內(nèi)普遍存在[3]。是枸杞果、葉、柄中主要的生物堿之一，在體內(nèi)起甲基供體作用，有許多優(yōu)良的藥理作用，是枸杞中對(duì)脂類代謝或抗脂肪肝的主要活性物質(zhì)[4]。甜菜堿是最好的滲透調(diào)節(jié)劑，較低濃度的甜菜堿即有滲透調(diào)節(jié)的作用，具有保護(hù)細(xì)胞抵抗外界高滲透等作用，能有效避免高濃度無(wú)機(jī)離子對(duì)酶和代謝的毒害，還可以通過(guò)自身的積累來(lái)減少水分喪失[5]，甜菜堿還可以防止因膽汁酸誘導(dǎo)的肝臟細(xì)胞凋亡，對(duì)多種肝臟疾病有很好的治療作用[6]。

查閱參考文獻(xiàn)得出，寧夏產(chǎn)甜菜堿含量為0.776%[7]，靖遠(yuǎn)產(chǎn)枸杞甜菜堿含量為1.6%[8]，民勤產(chǎn)枸杞甜菜堿含量為1.64%[9]，這些研究的側(cè)重點(diǎn)都在檢測(cè)方法的選擇上，未進(jìn)行提取條件的優(yōu)化，因此甜菜堿的提取率較低。目前對(duì)甜菜堿含量的測(cè)定方法主要有薄層色譜法[10]、高效液相色譜法[11]、離子色譜法[12]、比色法[13]等，這些方法都各有優(yōu)劣，試驗(yàn)采用的紫外分光光度計(jì)為各食品企業(yè)和市（縣）級(jí)檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)必配基本設(shè)備，試驗(yàn)所使用化學(xué)試劑毒性小，儀器運(yùn)行成本低，操作簡(jiǎn)單，適合基層檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)及中小型企業(yè)開展提取及檢測(cè)試驗(yàn)。

試驗(yàn)將通過(guò)單因素試驗(yàn)分析不同提取條件對(duì)枸杞甜菜堿提取的影響，然后在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝，同時(shí)優(yōu)化紫外分光光度檢測(cè)方法，為枸杞甜菜堿的開發(fā)提供理論依據(jù)，鼓勵(lì)企業(yè)優(yōu)選枸杞品種，提取枸杞有效成分，提高深加工能力，增加產(chǎn)品附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒泉市售枸杞；甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.2%），中國(guó)食品藥品檢定研究院；雷氏鹽（分析純），天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；丙酮、亞鐵氰化鉀、硫酸鋅（均為分析純），天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司。

甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取0.018 0 g甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL燒杯中，加少量蒸餾水，攪拌使之溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用蒸餾水定容。

飽和雷氏鹽溶液：稱取1.500 0 g雷氏鹽，加入90 mL蒸餾水，用濃鹽酸調(diào)pH至1.0，于室溫下不斷攪拌45 min，過(guò)濾，定容至100 mL（此溶液需現(xiàn)用現(xiàn)配）。

1.2 儀器與設(shè)備

SP-756P型紫外-可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；TG16型臺(tái)式高低速離心機(jī)，湖南湘儀設(shè)備公司；FE20型酸度計(jì)，瑞士梅特勒-托利多公司；SQP型電子天平，德國(guó)賽多利斯公司；DFT-100型手提式高速粉碎機(jī)，上海精勝科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 枸杞中甜菜堿的提取

枸杞中含有枸杞色素，如果不加處理，橙紅色提取液對(duì)比色有較大影響，因此需用活性炭吸附色素。枸杞樣品經(jīng)過(guò)不同條件的前處理后，粉碎，準(zhǔn)確稱取一定量枸杞粉末，加入浸提液，以1∶0.5加入活性炭，一定溫度下提取一段時(shí)間（具體見單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)），得到提取液，定量轉(zhuǎn)移上述提取液至容量瓶中。

1.3.2 甜菜堿檢測(cè)方法的優(yōu)化

檢測(cè)方法參考甜菜塊根中甜菜堿的檢測(cè)方法[14]，枸杞為高蛋白低脂肪食品，如不沉淀蛋白脂肪，提取液離心后會(huì)形成薄膜包裹甜菜堿，難溶于復(fù)溶劑，因此選亞鐵氰化鉀和硫酸鋅去除蛋白質(zhì)、脂肪等干擾性成分。提取液加入亞鐵氰化鉀（150 g/L）、硫酸鋅（300 g/L）各2 mL，充分混勻，加水定容至刻度，搖勻，放置5 min，上清液用定量濾紙過(guò)濾，得到枸杞甜菜堿的待測(cè)液。吸取2.00 mL待測(cè)液移入20 mL刻度離心管，加蓋后在冰箱（4 ℃）存放15 min，加入雷氏鹽溶液10 mL，再置入冰箱存放1 h，取出用10 000 r/min離心15 min。原方法是離心后棄去上清液，沉淀保留在原管中，實(shí)際操作很難實(shí)現(xiàn)沉淀不被帶出誤倒，導(dǎo)致甜菜堿有損失。本法為最大程度減少甜菜堿的損失，用定量濾紙過(guò)濾棄去上清液，用少量冰水輕輕沖洗濾紙1～2次，小心取下濾紙后展開，用10 mL 70%的丙酮溶液分3次將濾紙上的少量濾渣小心洗入原離心管，最大程度保留甜菜堿，在波長(zhǎng)525 nm處測(cè)定吸光度。

1.3.3 甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取7支試管，編號(hào)1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#，分別加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL的甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)溶液，再加入2.0，1.9，1.8，1.6，1.4，1.2和1.0 mL蒸餾水，使最后的總體積為2 mL，質(zhì)量濃度分別為：0，0.09，0.18，0.36，0.54，0.72和0.90 mg/mL。在冰箱（4 ℃）中存放15 min后分別滴加雷氏鹽溶液10 mL，再置入冰箱中1 h，后續(xù)操作同1.3.2，在波長(zhǎng)在525 nm處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

1.3.4.1 樣品預(yù)處理對(duì)枸杞甜菜堿的影響

枸杞含糖量較高，如果不進(jìn)行預(yù)處理，粉碎機(jī)無(wú)法粉碎，一般采用烘干法，但溫度太高枸杞會(huì)發(fā)黑，提取液呈黑紅色，不利于下一步試驗(yàn)開展。試驗(yàn)采用-18 ℃冷凍、60，80和100 ℃烘干分別處理8 h后，用高速粉碎機(jī)粉碎。預(yù)處理后稱取1.000 g試樣，加入0.5 g活性炭，加入150 mL純水作為提取液，室溫浸提1 h，定量轉(zhuǎn)移上述提取液至200 mL容量瓶中，按照

1.3.2 測(cè)得吸光度。

1.3.4.2 提取試劑對(duì)枸杞甜菜堿的影響

甜菜堿極易溶于水，易溶于甲醇，溶于乙醇，難溶于乙醚[15]，稱取1.000 g試樣，加入0.5 g活性炭，分別加入150 mL純水、50%甲醇、80%甲醇、50%乙醇、80%乙醇作為提取液，室溫浸提1 h，定量轉(zhuǎn)移上述提取液至200 mL容量瓶中，按照1.3.2測(cè)得吸光度。

1.3.4.3 料液比對(duì)枸杞甜菜堿的影響

枸杞多糖含量為3.0%～6.0%之間，枸杞多糖測(cè)定時(shí)，稱取量為0.4 g，提取液加入200 mL[16]，枸杞甜菜堿含量在1.0%以上，方法稱取試樣0.200，0.500，1.000，2.000和3.000 g，加入純水150 mL，得到料液比分別為1∶750，1∶300，1∶150，1∶75和1∶50（g/mL），按照稱樣量1∶0.5加入活性炭，室溫浸提1 h，定量轉(zhuǎn)移上述提取液至200 mL容量瓶中，按照

1.3.2 測(cè)得吸光度。

1.3.4.4 提取溫度對(duì)枸杞甜菜堿的影響

稱取1.000 g試樣，加入0.5 g活性炭，加入150 mL純水作為提取液，放入水浴鍋中，分別在室溫、40，60，80和100 ℃沸水浴中提取1 h，定量轉(zhuǎn)移上述提取液至200 mL容量瓶中，按照1.3.2測(cè)得吸光度。

1.3.4.5 提取時(shí)間對(duì)枸杞甜菜堿的影響

稱取1.000 g試樣，加入0.5 g活性炭，加入150 mL純水作為提取液，在室溫下分別浸提0.5，1，2，3和4 h，定量轉(zhuǎn)移上述提取液至200 mL容量瓶中，按照1.3.2測(cè)得吸光度。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取料液比（A）、提取溫度（B）、提取時(shí)間（C）作為自變量，枸杞甜菜堿得率為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)。具體試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

1.4 數(shù)據(jù)處理

每次試驗(yàn)平行3次，采用Origin 85數(shù)據(jù)處理軟件分析結(jié)果并制圖，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，采用Design-Expert 8.0對(duì)響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)行分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)曲線

以甜菜堿的濃度為x軸，吸光度為y軸，繪制甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.164 5x+0.003 7（R2=0.999 73）。式中：m1為試樣檢測(cè)液中的甜菜堿含量，mg；V為甜菜堿提取液的定容體積，mL；V1為甜菜堿待測(cè)液的吸取體積，mL；m為試樣的質(zhì)量，g。

圖1 甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 樣品前處理方法對(duì)枸杞甜菜堿得率的影響

圖2為前處理方法對(duì)甜菜堿得率的影響，枸杞樣品經(jīng)過(guò)60 ℃烘干干燥，性狀依然較軟，不能由粉碎機(jī)充分粉碎，80 ℃和100 ℃干燥后，可以充分粉碎，但是粉末經(jīng)水浸提后溶液發(fā)黑，活性炭不能有效祛除色素。枸杞樣品經(jīng)-18 ℃冷凍后，易粉碎，提取液微橘色，經(jīng)活性炭處理后溶液澄清透明，有利于比色分析。-18 ℃冷凍處理過(guò)的甜菜堿提取率高于烘干處理的，這可能是冷凍處理，枸杞有效成分損失較少，因此，枸杞甜菜堿提取前處理?xiàng)l件宜為-18 ℃冷凍8 h。

圖2 前處理方法對(duì)甜菜堿得率的影響

2.2.2 提取試劑對(duì)枸杞甜菜堿得率的影響

圖3為提取試劑對(duì)甜菜堿得率的影響，純水對(duì)甜菜堿的提取率最高，這可能和甜菜堿極易溶于水有關(guān)，50%甲醇、50%乙醇和80%的乙醇對(duì)甜菜堿的提取率無(wú)明顯差異。純水性質(zhì)最穩(wěn)定，提取率誤差最低。提取到的甜菜堿將用于食品及化妝品，從安全及成本考慮，枸杞甜菜堿提取劑宜選用純水。

圖3 提取試劑對(duì)甜菜堿得率的影響

2.2.3 料液比對(duì)枸杞甜菜堿得率的影響

圖4為料液比對(duì)甜菜堿得率的影響，純水室溫浸提1 h，甜菜堿得率隨著料液比的減少而升高，料液比為1∶150（g/mL）時(shí)，甜菜堿得率為1.97%，料液比為1∶75（g/mL）時(shí)，甜菜堿得率為1.99%，料液比為1∶50（g/mL）時(shí)，甜菜堿得率下降。料液比增加，甜菜堿與溶劑充分接觸并擴(kuò)散[17]，當(dāng)料液比達(dá)到某一臨界值時(shí)，隨著稱樣量的增大，甜菜堿不能全部轉(zhuǎn)移到溶劑中，造成提取不完全，甜菜堿得率降低。因此，枸杞甜菜堿提取的料液比宜選1∶150（g/mL）。

圖4 料液比對(duì)甜菜堿得率的影響

2.2.4 提取溫度對(duì)枸杞甜菜堿得率的影響

圖5為提取溫度對(duì)甜菜堿得率的影響，在料液比1∶150（g/mL），純水浸提1 h條件下，甜菜堿的提取率隨著溫度的升高而增大，溫度在80 ℃時(shí)，和沸水浴時(shí)甜菜堿得率持平。這是因?yàn)闇囟壬撸肿舆\(yùn)動(dòng)速度加快，細(xì)胞間的摩擦作用導(dǎo)致細(xì)胞破裂，同時(shí)甜菜堿較耐高溫，溶解及擴(kuò)散程度加快，得率提高，因此，枸杞甜菜堿提取的溫度宜選80 ℃。

2.2.5 提取時(shí)間對(duì)枸杞甜菜堿得率的影響

圖6為提取時(shí)間對(duì)甜菜堿得率的影響，在料液比1∶150（g/mL），純水室溫浸提條件下，甜菜堿的提取率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，從0.5 h到1 h，提取率有較大的提高，此后增加變緩，可能是甜菜堿從枸杞擴(kuò)散到水中需要一定時(shí)間，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，甜菜堿的釋放量增加，但釋放速度較快，1 h即達(dá)到臨界值，此后隨略有增加，但增勢(shì)平緩。因此，枸杞甜菜堿提取的時(shí)間宜選1 h。

圖5 提取溫度對(duì)甜菜堿得率的影響

圖6 提取時(shí)間對(duì)甜菜堿得率的影響

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

利用Design-Expert 8.0軟件對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合，獲得枸杞甜菜堿得率（Y）對(duì)料液比（A）、提取溫度（B）、提取時(shí)間（C）的二次回歸模型方程為：Y=0.374+0.45A+0.53B+0.15C+0.22AB+0.025AC-0.17BC-1.33A2-0.11B2+0.011C2。

由表3可得，對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，回歸模型極顯著（p＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（p=0.209 5＞0.05），表明回歸方程擬合程度良好，未知因素對(duì)試驗(yàn)?zāi)Ｐ陀绊戄^小；決定系數(shù)R2=0.989 3，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.975 5，說(shuō)明方程對(duì)試驗(yàn)擬合較好；R2Pred=0.883 7，說(shuō)明該模型預(yù)測(cè)性良好，利用此方程分析預(yù)測(cè)枸杞甜菜堿的最優(yōu)提取條件是可行的。

回歸方程系數(shù)的顯著性分析結(jié)果表明，料液比（A）、提取溫度（B）對(duì)甜菜堿得率的影響極顯著（p＜0.000 1），提取時(shí)間（C）對(duì)甜菜堿得率的影響顯著（p＜0.05）；從F值可知，以上三因素對(duì)甜菜堿提取效果影響的順序?yàn)椋禾崛囟龋˙）＞料液比（A）＞提取時(shí)間（C）。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 回歸模型方差分析

兩因素交互作用中，AB、BC對(duì)提取效果影響顯著（p＜0.05），AC對(duì)提取效果的影響不顯著（p＞0.05）。比較三維響應(yīng)面圖可知（圖7），料液比和提取溫度、料液比和提取時(shí)間對(duì)甜菜堿得率的影響顯著，其曲線都較陡。這與回歸方程各項(xiàng)方差分析結(jié)果相一致。

2.4 最佳提取條件的確定

綜合回歸模型的統(tǒng)計(jì)分析可知，枸杞甜菜堿的最佳提取工藝參數(shù)為：料液比1∶130.25（g/mL），提取時(shí)間為1 h，提取溫度為100 ℃。此條件下甜菜堿理論提取率為4.20%?？紤]到試驗(yàn)的可操作性，將甜菜堿提取工藝設(shè)為枸杞經(jīng)過(guò)-18 ℃冷凍8 h，以純水為提取劑，料液比1∶150（g/mL），提取溫度100 ℃，提取時(shí)間1 h為最優(yōu)提取工藝，此條件下甜菜堿提取率為4.05%，試驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明工藝優(yōu)化方法可行。

圖7 各因素交互作用對(duì)甜菜堿得率的影響

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)及回收率

用甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行加標(biāo)回收，選取2組市售特優(yōu)、特級(jí)枸杞分別進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)：稱取1.000 g枸杞粉末，其中一個(gè)250 mL具塞錐形瓶中加入30 mg/10 mL的甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)溶液10 mL，同一試驗(yàn)條件、試驗(yàn)方法處理測(cè)定，計(jì)算其回收率，表4為兩組樣品的實(shí)測(cè)值與加標(biāo)回收實(shí)測(cè)值。

通過(guò)表4可知，特級(jí)枸杞甜菜堿含量為3.59%和4.05%，回收率分別為94.67%和85.00%，表明在試驗(yàn)的提取條件和測(cè)定條件下枸杞中甜菜堿可以被有效分離和高效回收。也說(shuō)明甜菜堿是枸杞中的主要有效成分之一，其含量高低也可以作為枸杞品質(zhì)等級(jí)劃分的重要參考指標(biāo)。

表4 甜菜堿的回收率

3 結(jié)論與討論

1) 采用試驗(yàn)方法提取檢測(cè)枸杞中甜菜堿含量可達(dá)4.0%以上，遠(yuǎn)高于其他方法的1.0%左右，主要是因?yàn)楸痉椒▋?yōu)化了甜菜堿的提取條件，確定了甜菜堿的最佳提取工藝為枸杞經(jīng)過(guò)-18 ℃冷凍8 h，以純水為提取劑，料液比1∶150（g/mL），提取溫度100 ℃，提取時(shí)間1 h，此條件下枸杞甜菜堿提取率最高。同時(shí)優(yōu)化了檢測(cè)條件，用活性炭、亞鐵氰化鉀、硫酸鋅去除色素、蛋白質(zhì)、脂肪等干擾性成分，提高了待測(cè)液的穩(wěn)定性。

2) 枸杞因其具有極強(qiáng)的耐旱、耐鹽堿和耐貧瘠性，主要產(chǎn)區(qū)分布在寧夏、甘肅、新疆、內(nèi)蒙、青海等我國(guó)西北地區(qū)。這些地區(qū)的枸杞多以干果形式銷售，加工程度低，屬初級(jí)農(nóng)產(chǎn)品，對(duì)于枸杞有效成分的研究與開發(fā)較少，尤其是對(duì)甜菜堿的開發(fā)利用幾乎沒(méi)有。確定枸杞甜菜堿的提取和檢測(cè)方法，將對(duì)其深加工提供參考，促進(jìn)產(chǎn)業(yè)升級(jí)，提高枸杞產(chǎn)品競(jìng)爭(zhēng)力和市場(chǎng)占有率。且本方法簡(jiǎn)單易操作，使用儀器設(shè)備均為實(shí)驗(yàn)室基本配置，使用化學(xué)試劑毒性小，檢驗(yàn)人員只需具備基本的化學(xué)檢驗(yàn)基礎(chǔ)就能操作，適合中小型企業(yè)及基層檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)開展提取及檢測(cè)試驗(yàn)。