枸杞甜菜堿檢測方法及提取工藝的優化

史蓉，李婷婷，王蓉，周麗

酒泉市食品檢驗檢測中心（酒泉 735000）

枸杞（Lycium barbarum）是茄目茄科枸杞屬植物，是名貴的中藥材和保健品[1]。枸杞口感微甜，含有豐富的營養成分，具有補腎生精，養肝，明目安神，降血脂，抗氧化等方面的功效[2]，被廣泛用于功能性食品的研究與開發，在我國的食品、保健品和醫藥業方面占據了重要地位。

甜菜堿（Betaine）是一種季胺型生物堿，學名三甲基胺乙內酯，作為一種滲透調節物質在高等植物體內普遍存在[3]。是枸杞果、葉、柄中主要的生物堿之一，在體內起甲基供體作用，有許多優良的藥理作用，是枸杞中對脂類代謝或抗脂肪肝的主要活性物質[4]。甜菜堿是最好的滲透調節劑，較低濃度的甜菜堿即有滲透調節的作用，具有保護細胞抵抗外界高滲透等作用，能有效避免高濃度無機離子對酶和代謝的毒害，還可以通過自身的積累來減少水分喪失[5]，甜菜堿還可以防止因膽汁酸誘導的肝臟細胞凋亡，對多種肝臟疾病有很好的治療作用[6]。

查閱參考文獻得出，寧夏產甜菜堿含量為0.776%[7]，靖遠產枸杞甜菜堿含量為1.6%[8]，民勤產枸杞甜菜堿含量為1.64%[9]，這些研究的側重點都在檢測方法的選擇上，未進行提取條件的優化，因此甜菜堿的提取率較低。目前對甜菜堿含量的測定方法主要有薄層色譜法[10]、高效液相色譜法[11]、離子色譜法[12]、比色法[13]等，這些方法都各有優劣，試驗采用的紫外分光光度計為各食品企業和市（縣）級檢驗機構必配基本設備，試驗所使用化學試劑毒性小，儀器運行成本低，操作簡單，適合基層檢驗機構及中小型企業開展提取及檢測試驗。

試驗將通過單因素試驗分析不同提取條件對枸杞甜菜堿提取的影響，然后在單因素試驗結果的基礎上采用響應面試驗設計優化提取工藝，同時優化紫外分光光度檢測方法，為枸杞甜菜堿的開發提供理論依據，鼓勵企業優選枸杞品種，提取枸杞有效成分，提高深加工能力，增加產品附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒泉市售枸杞；甜菜堿標準品（純度99.2%），中國食品藥品檢定研究院；雷氏鹽（分析純），天津光復精細化工研究所；丙酮、亞鐵氰化鉀、硫酸鋅（均為分析純），天津市凱信化學工業有限公司。

甜菜堿標準溶液：稱取0.018 0 g甜菜堿標準品于10 mL燒杯中，加少量蒸餾水，攪拌使之溶解，轉移至10 mL容量瓶中，用蒸餾水定容。

飽和雷氏鹽溶液：稱取1.500 0 g雷氏鹽，加入90 mL蒸餾水，用濃鹽酸調pH至1.0，于室溫下不斷攪拌45 min，過濾，定容至100 mL（此溶液需現用現配）。

1.2 儀器與設備

SP-756P型紫外-可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；TG16型臺式高低速離心機，湖南湘儀設備公司；FE20型酸度計，瑞士梅特勒-托利多公司；SQP型電子天平，德國賽多利斯公司；DFT-100型手提式高速粉碎機，上海精勝科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 枸杞中甜菜堿的提取

枸杞中含有枸杞色素，如果不加處理，橙紅色提取液對比色有較大影響，因此需用活性炭吸附色素。枸杞樣品經過不同條件的前處理后，粉碎，準確稱取一定量枸杞粉末，加入浸提液，以1∶0.5加入活性炭，一定溫度下提取一段時間（具體見單因素及響應面試驗），得到提取液，定量轉移上述提取液至容量瓶中。

1.3.2 甜菜堿檢測方法的優化

檢測方法參考甜菜塊根中甜菜堿的檢測方法[14]，枸杞為高蛋白低脂肪食品，如不沉淀蛋白脂肪，提取液離心后會形成薄膜包裹甜菜堿，難溶于復溶劑，因此選亞鐵氰化鉀和硫酸鋅去除蛋白質、脂肪等干擾性成分。提取液加入亞鐵氰化鉀（150 g/L）、硫酸鋅（300 g/L）各2 mL，充分混勻，加水定容至刻度，搖勻，放置5 min，上清液用定量濾紙過濾，得到枸杞甜菜堿的待測液。吸取2.00 mL待測液移入20 mL刻度離心管，加蓋后在冰箱（4 ℃）存放15 min，加入雷氏鹽溶液10 mL，再置入冰箱存放1 h，取出用10 000 r/min離心15 min。原方法是離心后棄去上清液，沉淀保留在原管中，實際操作很難實現沉淀不被帶出誤倒，導致甜菜堿有損失。本法為最大程度減少甜菜堿的損失，用定量濾紙過濾棄去上清液，用少量冰水輕輕沖洗濾紙1～2次，小心取下濾紙后展開，用10 mL 70%的丙酮溶液分3次將濾紙上的少量濾渣小心洗入原離心管，最大程度保留甜菜堿，在波長525 nm處測定吸光度。

1.3.3 甜菜堿標準曲線的繪制

取7支試管，編號1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#，分別加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL的甜菜堿標準溶液，再加入2.0，1.9，1.8，1.6，1.4，1.2和1.0 mL蒸餾水，使最后的總體積為2 mL，質量濃度分別為：0，0.09，0.18，0.36，0.54，0.72和0.90 mg/mL。在冰箱（4 ℃）中存放15 min后分別滴加雷氏鹽溶液10 mL，再置入冰箱中1 h，后續操作同1.3.2，在波長在525 nm處測定吸光度，繪制標準曲線。

1.3.4 單因素試驗

1.3.4.1 樣品預處理對枸杞甜菜堿的影響

枸杞含糖量較高，如果不進行預處理，粉碎機無法粉碎，一般采用烘干法，但溫度太高枸杞會發黑，提取液呈黑紅色，不利于下一步試驗開展。試驗采用-18 ℃冷凍、60，80和100 ℃烘干分別處理8 h后，用高速粉碎機粉碎。預處理后稱取1.000 g試樣，加入0.5 g活性炭，加入150 mL純水作為提取液，室溫浸提1 h，定量轉移上述提取液至200 mL容量瓶中，按照

1.3.2 測得吸光度。

1.3.4.2 提取試劑對枸杞甜菜堿的影響

甜菜堿極易溶于水，易溶于甲醇，溶于乙醇，難溶于乙醚[15]，稱取1.000 g試樣，加入0.5 g活性炭，分別加入150 mL純水、50%甲醇、80%甲醇、50%乙醇、80%乙醇作為提取液，室溫浸提1 h，定量轉移上述提取液至200 mL容量瓶中，按照1.3.2測得吸光度。

1.3.4.3 料液比對枸杞甜菜堿的影響

枸杞多糖含量為3.0%～6.0%之間，枸杞多糖測定時，稱取量為0.4 g，提取液加入200 mL[16]，枸杞甜菜堿含量在1.0%以上，方法稱取試樣0.200，0.500，1.000，2.000和3.000 g，加入純水150 mL，得到料液比分別為1∶750，1∶300，1∶150，1∶75和1∶50（g/mL），按照稱樣量1∶0.5加入活性炭，室溫浸提1 h，定量轉移上述提取液至200 mL容量瓶中，按照

1.3.2 測得吸光度。

1.3.4.4 提取溫度對枸杞甜菜堿的影響

稱取1.000 g試樣，加入0.5 g活性炭，加入150 mL純水作為提取液，放入水浴鍋中，分別在室溫、40，60，80和100 ℃沸水浴中提取1 h，定量轉移上述提取液至200 mL容量瓶中，按照1.3.2測得吸光度。

1.3.4.5 提取時間對枸杞甜菜堿的影響

稱取1.000 g試樣，加入0.5 g活性炭，加入150 mL純水作為提取液，在室溫下分別浸提0.5，1，2，3和4 h，定量轉移上述提取液至200 mL容量瓶中，按照1.3.2測得吸光度。

1.3.5 響應面試驗優化

在單因素試驗結果的基礎上，選取料液比（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）作為自變量，枸杞甜菜堿得率為響應值，進行三因素三水平的試驗設計。具體試驗因素水平見表1。

表1 響應面試驗因素水平表

1.4 數據處理

每次試驗平行3次，采用Origin 85數據處理軟件分析結果并制圖，對數據進行單因素方差分析，采用Design-Expert 8.0對響應面結果進行分析和作圖。

2 結果與分析

2.1 甜菜堿標準曲線

以甜菜堿的濃度為x軸，吸光度為y軸，繪制甜菜堿標準曲線如圖1，得標準曲線回歸方程為：y=0.164 5x+0.003 7（R2=0.999 73）。式中：m1為試樣檢測液中的甜菜堿含量，mg；V為甜菜堿提取液的定容體積，mL；V1為甜菜堿待測液的吸取體積，mL；m為試樣的質量，g。

圖1 甜菜堿標準曲線

2.2 單因素試驗

2.2.1 樣品前處理方法對枸杞甜菜堿得率的影響

圖2為前處理方法對甜菜堿得率的影響，枸杞樣品經過60 ℃烘干干燥，性狀依然較軟，不能由粉碎機充分粉碎，80 ℃和100 ℃干燥后，可以充分粉碎，但是粉末經水浸提后溶液發黑，活性炭不能有效祛除色素。枸杞樣品經-18 ℃冷凍后，易粉碎，提取液微橘色，經活性炭處理后溶液澄清透明，有利于比色分析。-18 ℃冷凍處理過的甜菜堿提取率高于烘干處理的，這可能是冷凍處理，枸杞有效成分損失較少，因此，枸杞甜菜堿提取前處理條件宜為-18 ℃冷凍8 h。

圖2 前處理方法對甜菜堿得率的影響

2.2.2 提取試劑對枸杞甜菜堿得率的影響

圖3為提取試劑對甜菜堿得率的影響，純水對甜菜堿的提取率最高，這可能和甜菜堿極易溶于水有關，50%甲醇、50%乙醇和80%的乙醇對甜菜堿的提取率無明顯差異。純水性質最穩定，提取率誤差最低。提取到的甜菜堿將用于食品及化妝品，從安全及成本考慮，枸杞甜菜堿提取劑宜選用純水。

圖3 提取試劑對甜菜堿得率的影響

2.2.3 料液比對枸杞甜菜堿得率的影響

圖4為料液比對甜菜堿得率的影響，純水室溫浸提1 h，甜菜堿得率隨著料液比的減少而升高，料液比為1∶150（g/mL）時，甜菜堿得率為1.97%，料液比為1∶75（g/mL）時，甜菜堿得率為1.99%，料液比為1∶50（g/mL）時，甜菜堿得率下降。料液比增加，甜菜堿與溶劑充分接觸并擴散[17]，當料液比達到某一臨界值時，隨著稱樣量的增大，甜菜堿不能全部轉移到溶劑中，造成提取不完全，甜菜堿得率降低。因此，枸杞甜菜堿提取的料液比宜選1∶150（g/mL）。

圖4 料液比對甜菜堿得率的影響

2.2.4 提取溫度對枸杞甜菜堿得率的影響

圖5為提取溫度對甜菜堿得率的影響，在料液比1∶150（g/mL），純水浸提1 h條件下，甜菜堿的提取率隨著溫度的升高而增大，溫度在80 ℃時，和沸水浴時甜菜堿得率持平。這是因為溫度升高，分子運動速度加快，細胞間的摩擦作用導致細胞破裂，同時甜菜堿較耐高溫，溶解及擴散程度加快，得率提高，因此，枸杞甜菜堿提取的溫度宜選80 ℃。

2.2.5 提取時間對枸杞甜菜堿得率的影響

圖6為提取時間對甜菜堿得率的影響，在料液比1∶150（g/mL），純水室溫浸提條件下，甜菜堿的提取率隨著時間的延長而提高，從0.5 h到1 h，提取率有較大的提高，此后增加變緩，可能是甜菜堿從枸杞擴散到水中需要一定時間，隨著時間的延長，甜菜堿的釋放量增加，但釋放速度較快，1 h即達到臨界值，此后隨略有增加，但增勢平緩。因此，枸杞甜菜堿提取的時間宜選1 h。

圖5 提取溫度對甜菜堿得率的影響

圖6 提取時間對甜菜堿得率的影響

2.3 響應面試驗設計及結果

利用Design-Expert 8.0軟件對表2試驗數據進行線性擬合，獲得枸杞甜菜堿得率（Y）對料液比（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）的二次回歸模型方程為：Y=0.374+0.45A+0.53B+0.15C+0.22AB+0.025AC-0.17BC-1.33A2-0.11B2+0.011C2。

由表3可得，對回歸模型進行方差分析，回歸模型極顯著（p＜0.000 1），失擬項不顯著（p=0.209 5＞0.05），表明回歸方程擬合程度良好，未知因素對試驗模型影響較小；決定系數R2=0.989 3，調整決定系數R2Adj=0.975 5，說明方程對試驗擬合較好；R2Pred=0.883 7，說明該模型預測性良好，利用此方程分析預測枸杞甜菜堿的最優提取條件是可行的。

回歸方程系數的顯著性分析結果表明，料液比（A）、提取溫度（B）對甜菜堿得率的影響極顯著（p＜0.000 1），提取時間（C）對甜菜堿得率的影響顯著（p＜0.05）；從F值可知，以上三因素對甜菜堿提取效果影響的順序為：提取溫度（B）＞料液比（A）＞提取時間（C）。

表2 Box-Behnken試驗設計及結果

表3 回歸模型方差分析

兩因素交互作用中，AB、BC對提取效果影響顯著（p＜0.05），AC對提取效果的影響不顯著（p＞0.05）。比較三維響應面圖可知（圖7），料液比和提取溫度、料液比和提取時間對甜菜堿得率的影響顯著，其曲線都較陡。這與回歸方程各項方差分析結果相一致。

2.4 最佳提取條件的確定

綜合回歸模型的統計分析可知，枸杞甜菜堿的最佳提取工藝參數為：料液比1∶130.25（g/mL），提取時間為1 h，提取溫度為100 ℃。此條件下甜菜堿理論提取率為4.20%。考慮到試驗的可操作性，將甜菜堿提取工藝設為枸杞經過-18 ℃冷凍8 h，以純水為提取劑，料液比1∶150（g/mL），提取溫度100 ℃，提取時間1 h為最優提取工藝，此條件下甜菜堿提取率為4.05%，試驗結果與預測值接近，說明工藝優化方法可行。

圖7 各因素交互作用對甜菜堿得率的影響

2.5 驗證試驗及回收率

用甜菜堿標準品進行加標回收，選取2組市售特優、特級枸杞分別進行加標回收試驗：稱取1.000 g枸杞粉末，其中一個250 mL具塞錐形瓶中加入30 mg/10 mL的甜菜堿標準溶液10 mL，同一試驗條件、試驗方法處理測定，計算其回收率，表4為兩組樣品的實測值與加標回收實測值。

通過表4可知，特級枸杞甜菜堿含量為3.59%和4.05%，回收率分別為94.67%和85.00%，表明在試驗的提取條件和測定條件下枸杞中甜菜堿可以被有效分離和高效回收。也說明甜菜堿是枸杞中的主要有效成分之一，其含量高低也可以作為枸杞品質等級劃分的重要參考指標。

表4 甜菜堿的回收率

3 結論與討論

1) 采用試驗方法提取檢測枸杞中甜菜堿含量可達4.0%以上，遠高于其他方法的1.0%左右，主要是因為本方法優化了甜菜堿的提取條件，確定了甜菜堿的最佳提取工藝為枸杞經過-18 ℃冷凍8 h，以純水為提取劑，料液比1∶150（g/mL），提取溫度100 ℃，提取時間1 h，此條件下枸杞甜菜堿提取率最高。同時優化了檢測條件，用活性炭、亞鐵氰化鉀、硫酸鋅去除色素、蛋白質、脂肪等干擾性成分，提高了待測液的穩定性。

2) 枸杞因其具有極強的耐旱、耐鹽堿和耐貧瘠性，主要產區分布在寧夏、甘肅、新疆、內蒙、青海等我國西北地區。這些地區的枸杞多以干果形式銷售，加工程度低，屬初級農產品，對于枸杞有效成分的研究與開發較少，尤其是對甜菜堿的開發利用幾乎沒有。確定枸杞甜菜堿的提取和檢測方法，將對其深加工提供參考，促進產業升級，提高枸杞產品競爭力和市場占有率。且本方法簡單易操作，使用儀器設備均為實驗室基本配置，使用化學試劑毒性小，檢驗人員只需具備基本的化學檢驗基礎就能操作，適合中小型企業及基層檢驗機構開展提取及檢測試驗。