五味子果渣低醇飲料發酵工藝優化

張晟，馬雪，李楊，郭麗*

綏化學院食品與制藥工程學院（綏化 152061）

五味子俗稱北五味子，為常用滋補強壯中藥，五味子中含有多糖、木質素、揮發油等生物活性成分[1]。五味子提取物具有保肝、抗腫瘤、抗炎、抗潰瘍、抗氧化、解毒等多種藥理作用，在醫藥上具有重要的應用價值[2-5]。隨著人們對五味子功效的認識，關于五味子產品的研究也越來越多，如五味子保健飲料[6]、果醬[7]、果醋[8]、果酒[9-10]等，相關的產品也逐年增多。因此，五味子加工過程中產生的大量果渣，而大部分果渣被丟棄，未得到充分利用，對環境造成嚴重影響。

低醇飲料是利用果蔬等為原料，通過酵母適當發酵而成的高營養活性飲料。在微生物及酶的作用下，許多活性因子在發酵的過程中得到釋放，目前在歐美一些發達國家，低醇飲料更是受到極大的歡迎[11-12]，相關產品也逐漸問世，但我國在以果蔬為原料發酵生產低醇飲料相對較少，而且國內外關于五味子果渣低醇飲料開發和研究的文獻仍鮮見報道。

試驗以五味子果渣為原料，研究低醇飲料的發酵工藝與最佳參數，為五味子產品的深加工產品的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

五味子果渣，新鮮五味子購自寧安市北域珍奇山林食品有限公司，壓榨后的果渣真空冷凍干燥，備用；釀酒酵母1012（Saccharomyces cerevisiae），中國工業微生物菌種保藏管理中心；甲醇（色譜純）、五味子酯甲（色譜純）、YPD培養基、濃硫酸、濃鹽酸、無水乙醇、苯酚、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、檸檬酸，均購于哈爾濱盛世天澤生物科技有限公司；白砂糖，市售。

1.2 儀器與設備

TP310 pH分析儀，北京時代新維測控設備有限公司；DNP電熱恒溫培養箱，揚州恒都電子科技有限公司；九陽JYZ-V15榨汁機，九陽股份有限公司；阿貝折光儀，上海明茲精密儀器廠；8500紫外分光光度計，山東博科生物產業有限公司；DZKW-S-4型恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市友聯儀器研究所。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

五味子果渣→解凍→加水破碎→五味子汁→成分調整→加偏壓硫酸鉀→酵母活化→接種→恒溫發酵→終止發酵→壓榨→澄清→殺菌成分檢測→灌裝→成品

1.3.2 操作要點

將冷凍儲存的五味子果渣進行常溫解凍，按照1∶3的比例添加無菌飲用水，放入榨汁機中，打碎成漿，用碳酸氫鈉或檸檬酸調節pH（自然pH為3.3），添加2%白砂糖（根據預試驗，得到發酵液的酒度為1%vol），按100 mg/L加入偏壓硫酸鉀，12 h后加入活化好的酵母菌種子液（無菌條件下，從甘油培養基中取菌株一環，將其接入100 mL配制好的YPD液體培養基，設置恒溫培養條件：溫度28 ℃、轉速150 r/min、培養時間12 h，得到活化的種子液），攪拌均勻后倒入發酵罐中于不同的溫度下發酵，發酵結束后進行壓榨，將皮渣進行分離，得到發酵液，將發酵液用0.45 μm濾膜微濾進行澄清處理，隨后在63 ℃水浴條件下殺菌30 min，放置常溫后進行成分的測定，得到成品。1.3.3 單因素試驗

1.3.3.1 初始pH對五味子低醇飲料品質的影響

稱量適量的五味子漿液，用白砂糖調整糖度為2%，調節pH為3.0，3.5，4.0，4.5和5.0，按照6%的接種量進行接種，在28 ℃條件下進行72 h的發酵，發酵結束后測定五味子發酵液的酒精度，進行感官評價，確定適宜的接種量。

1.3.3.2 接種量對五味子低醇飲料品質的影響

稱量適量的五味子漿液，用白砂糖調整糖度為2%，調節pH為4.0，按照2%，4%，6%，8%和10%的接種量進行接種，在28 ℃條件下進行72 h的發酵，發酵結束后測定五味子發酵液的酒精度，進行感官評價，確定適宜的接種量。

1.3.3.3 發酵溫度對五味子低醇飲料品質的影響

稱量適量的五味子漿液，用白砂糖調整糖度為2%，調節pH為4.0，按照6%的接種量進行接種，調整發酵溫度為22，25，28，31和34 ℃，發酵72 h，發酵結束后測定五味子發酵液的酒精度，進行感官評價，確定適宜的接種量。

1.3.3.4 發酵時間對五味子低醇飲料品質的影響

稱量適量的五味子漿液，用白砂糖調整糖度為2%，調節pH為4.0，按照6%的接種量進行接種，在28℃條件下進行24，48，72，96和120 h的發酵，發酵結束后測定五味子發酵液的酒精度，進行感官評價，確定適宜的接種量。

1.3.4 五味子低醇飲料發酵工藝參數優化

利用響應曲面分析的方法優化出其適合的發酵條件，采取初始pH、接種量、發酵溫度與發酵時間為自變量，將感官綜合值作為R值，通過四因素三水平響應曲面設計，得出其最佳工藝條件，如表1所示。

表1 Box-Behnken試驗因素水平表

1.3.5 理化指標的測定

pH采用pH分析儀測定；酒精度采用比重計法測定；含糖量采用手持折光儀測定；可滴定酸采用酸堿滴定法測定；還原糖含量采用斐林滴定法測定[13]；總木質素采用比色法測定[14]；多糖采用苯酚-硫酸法測定[14]；花色苷參照劉長姣[15]和Pertuzatti等[16]的方法測定。

1.3.6 微生物指標的測定

參照GB/T 4789—2003[17]進行測定。

1.3.7 感官評價方法

請20位具有一定食品感官評定基礎的品嘗者對每一批五味子低醇發酵飲料進行感官評定[18]。滿分為100分，具體標準見表2。

表2 感官評分標準

2 結果與分析

2.1 初始pH對五味子低醇飲料品質的影響

由圖1可知，隨著pH的不斷增加，五味子低醇飲料的酒精度也隨之增加，當pH達到4.0時，酒精度達到最高，證明發酵最為充分。而后，隨著pH的繼續增加，其酒精度變化較緩慢。這是因為在較低的pH條件下，酵母菌的生長受到抑制，因此不利于其充分的發酵，而過高的pH會使得一些雜菌生長而消耗體系內的營養物質，使得酵母菌生長受限[19]；另外，過低的pH也會使得發酵飲料的口感過酸，影響飲料的口感；而較高的發酵初始pH會由于雜菌的生長產生不良異味，同樣會影響口感。因此選擇發酵pH 4.0為好。

圖1 初始pH對五味子低醇飲料品質的影響

2.2 接種量對五味子低醇飲料品質的影響

隨著接種量的增加，其酒精度也隨之增加，當接種量為6%時，其酒精度達到最大，而后隨著接種量的增加，酒精度變化不顯著。這是因為在較低的接種量時，發酵液中的糖分無法被充分利用，進而使得發酵不完全。當接種量較低時，由于發酵不完全，發酵飲料的醇香味不足，影響口感；若接種量過高時，酵母的生長和酵母自身的氣味同樣會影響發酵飲料的風味，因此當接種量為6%時，其感官評分最高。

圖2 接種量對五味子低醇飲料品質的影響

2.3 發酵溫度對五味子低醇飲料品質的影響

隨著發酵溫度的增加，其酒精度也隨之增加，當發酵溫度為28 ℃時，酒精度達到最大，而后不發生改變。這是由于發酵過程中酵母菌將大部分可發酵糖轉化為乙醇，溫度越高酵母的代謝速度越快。當發酵溫度較低時，酵母代謝速率較為緩慢，使得發酵不完全，醇香味變淡，因此口感不佳，而溫度過高時，產酸量越多，風味物質形成較少[20]。因此，最佳發酵溫度控制在28 ℃。

2.4 發酵時間對五味子低醇飲料品質的影響

由圖4可知，隨著發酵時間的增加，其酒精度迅速增加；當達到72 h時，其酒精度達到最大，隨后酒精度不變。其感官評分為先增加后下降的趨勢，這是由于發酵時間過短，酵母自身生長繁殖、代謝產物較少，產生乙醇量低，進而醇香味不足；發酵時間長，五味子中的風味物質會損失，果香味減弱，同時酸性物質也會增加，影響產品的風味。發酵72 h時，為最佳發酵時間。

圖3 發酵溫度對五味子低醇飲料品質的影響

圖4 發酵時間對五味子低醇飲料品質的影響

2.5 五味子低醇飲料發酵工藝參數優化

其試驗方案與設計見表3和表4。

通過統計分析軟件Design-Expert進行數據分析，得到關于R的方程：

從表4可以看到，此方程極顯著（p＜0.000 1），且失擬項不顯著，證明試驗擬合出的效果接近于理論的結果，均方值R2=96.82%，說明此響應曲面模型能解釋96.82%的響應變化，R2Adj=93.65%，從相反的方向說明僅僅有6.358%的總變異是此模型無法預測的，達到了非常高的擬合程度。通過F值大小能判斷出各因素的影響大小，由高至低依次為B＞A＞C＞D，即接種量＞初始pH＞發酵溫度＞發酵時間。

通過響應曲面模型可以得到，初始pH為4.02，酵母接種量為6.11%，發酵溫度為27.68 ℃，發酵時間為71.60 h，所得到的產品的感官評分達到94。結合實際生產中的工藝水平，調整到初始pH 4.0、酵母接種量6%、發酵溫度28 ℃、及發酵時間72 h。

表3 試驗方案及結果

表4 方差分析

為了驗證更為可靠的數據，采用上述的工藝條件進行三次驗證試驗，其感官評分結果所得到的平均值為93.33，與理論預測值相差0.67%。所以通過上述方法測定出的工藝條件是準確可靠的。

2.6 五味子果渣低醇飲料的品質指標

2.6.1 感官指標

產品呈酒紅色，清亮，光澤透明，無沉淀現象；口感細膩均勻，風味平衡；具有清新的五味子果香和濃郁的發酵香味。

2.6.2 理化指標

五味子果渣低醇飲料的主要成分見表5。

圖5 兩因素交互作用對酒精度影響的響應面圖

表5 五味子果渣低醇飲料主要成分

2.6.3 微生物指標

細菌總數（CFU/mL）≤100；大腸桿菌（MPN/100 mL）≤3；致病菌不得檢出。

3 結論

通過單因素試驗與響應面試驗可以發現，初始pH、接種量、發酵溫度、發酵時間對于五味子果渣低醇飲料的口感與酒精度有顯著的影響。五味子果渣經過調節初始pH 4.0、酵母接種量6%、發酵溫度28 ℃及發酵時間72 h，所得到的產品的酒精度為1.20%vol。此飲料呈酒紅色，清亮，光澤透明、無沉淀現象；口感細膩均勻，風味平衡；具有清新的五味子果香和濃郁的發酵香味。