限制性酶解燕麥蛋白功能特性和抗氧化活性

許英一，王彪，王宇，林巍，吳紅艷，余世鋒

1. 齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院（齊齊哈爾 161006）；2. 黑龍江省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)分院（齊齊哈爾 161005）

目前，對(duì)燕麥蛋白的研究主要集中在不同提取方法及功能性質(zhì)[3-5]，對(duì)燕麥蛋白酶解物的功能性質(zhì)等問(wèn)題研究很少，而對(duì)于不同水解度對(duì)燕麥蛋白酶解物功能特性及抗氧化活性的影響還未見(jiàn)報(bào)道。研究對(duì)堿提酸沉法得到的燕麥蛋白進(jìn)行不同程度的限制性酶解，對(duì)不同水解度的燕麥蛋白酶解物的溶解性、乳化性等功能特性及抗氧化活性進(jìn)行比較分析，以期獲得功能性和抗氧化性較好的燕麥蛋白酶解物，為燕麥蛋白的精深加工提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

燕麥蛋白：堿提酸沉法制備。堿性蛋白酶：酶活力1.0×105U/g，上海源葉生物科技有限公司。十二烷基硫酸鈉（SDS）：美國(guó)Sigma公司。1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：Sigma公司。Amino Acids Mixture Standard Solution，Type H：日本W(wǎng)ako公司。其他化學(xué)試劑：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

高速藥物粉碎機(jī)：WK-600A型，青州市精誠(chéng)機(jī)械有限公司。高速組織搗碎機(jī)：DS-1型，上海標(biāo)本模型制造廠。臺(tái)式低速離心機(jī)：TDL-5-A型，上海安亭科學(xué)儀器廠。pH計(jì)：PB-10型，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。水浴恒溫振蕩器：SHA-C型，常州榮華儀器制造有限公司。可見(jiàn)分光光度計(jì)：722S型，上海菁華科技儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 不同水解度燕麥蛋白酶解物的制備

脫脂燕麥粉（80目）→加水溶解[料液比1∶8（g/mL）]→酶解（堿性蛋白酶，酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間分別為1.0，2.0，3.0和4.0 h，酶解pH 8.0，酶加量2 g/100 g底物）→滅酶（90 ℃，10 min）→離心（4 000 r/min，10 min）→上清液→酸沉（pH 4.0）→沉淀凍干→燕麥蛋白酶解物

1.3.2 水解度DH的測(cè)定

水解過(guò)程中滴加0.5 mol/L NaOH溶液控制體系pH為最適值不變，用pH-Stat法[6]測(cè)定 DH，DH按式（1）計(jì)算：

式中：CNaOH為NaOH溶液的濃度，mol/L；VNaOH為消耗NaOH溶液體積，mL；Mp為底物中蛋白質(zhì)質(zhì)量，g；α為α-NH2的平均解離度；htot為每克蛋白中所含肽鍵總數(shù)，mmol/g蛋白質(zhì)。

探頭置于不同位置，聲束的截面隨著聲束入射點(diǎn)至缺陷處的弧長(zhǎng)而變化，調(diào)整相控陣探頭位置及聲束繪制的角度，使聲束覆蓋缺陷的最佳位置，采用超聲耦合劑進(jìn)行無(wú)縫粘結(jié)，再進(jìn)行聚焦延遲校準(zhǔn)、靈敏度校準(zhǔn)和DAC曲線校準(zhǔn)等，以提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性與適用性。A、B處的人工缺陷定位結(jié)果如圖14、圖15。

1.3.3 pH對(duì)燕麥蛋白酶解物功能特性的影響

在不同pH（2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0）條件下，以燕麥蛋白做陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)4種水解度的燕麥蛋白酶解物進(jìn)行功能特性分析，測(cè)定溶解性、乳化性和乳化穩(wěn)定性。

1.3.4 溶解性測(cè)定

參考文獻(xiàn)[7]進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5 乳化性和乳化穩(wěn)定性

采用濁度法[8]進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6 DPPH自由基清除率的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[9]進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所用試驗(yàn)均重復(fù)3次，各試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以x±s表示。采用Excel和SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同水解度燕麥蛋白酶解物的制備

以堿性蛋白酶水解燕麥蛋白，通過(guò)限制性酶解制備不同水解度的酶解物，水解度隨時(shí)間0～80 min變化如圖1所示。從圖1可以看出，水解開(kāi)始的前30 min隨著時(shí)間增加，堿性蛋白酶酶解燕麥蛋白的水解度（DH）急劇增大；30 min后DH增加變緩，這主要是因?yàn)閴A性蛋白酶是一種專一性較強(qiáng)的酶[10]，有其特定的肽鍵作用位點(diǎn)，隨著水解的進(jìn)行，蛋白底物中特定的肽鍵會(huì)越來(lái)越少。此外有部分蛋白酶會(huì)失活，并伴隨產(chǎn)物積累對(duì)酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制，所以水解速度會(huì)越來(lái)越慢。水解60 min后，DH趨于平緩。水解過(guò)程中收集了4，8，20，40和60 min的酶解物，其DH分別為5%，10%，15%和20%。

圖1 堿性蛋白酶對(duì)燕麥蛋白的水解進(jìn)程

2.2 燕麥蛋白酶解物溶解性

pH對(duì)不同水解度的燕麥蛋白酶解物的溶解性曲線如圖2所示。由圖2可知，不同水解度的酶解物的溶解性均高于未水解燕麥蛋白，這是因?yàn)樗膺^(guò)程中形成了極性更強(qiáng)的小分子肽，使酶解物的親水性增強(qiáng)，提高了溶解性[11]。同一pH下，隨著DH從5%增大到15%，溶解性逐漸增大，而在DH 20%時(shí)，溶解性相對(duì)較低，甚至pH為10和12時(shí)溶解性低于燕麥蛋白，這可能是因?yàn)樗舛忍?，可溶性小分子燕麥蛋白增加，這些小分子蛋白在高pH下變性，溶解性受到影響。在pH 4～6范圍內(nèi)，燕麥蛋白及酶解物的溶解性均最低，高于或低于此pH范圍溶解性均升高，這種溶解性的變化趨勢(shì)與劉穎等[12]研究限制性酶解米糠蛋白溶解性的變化一致，這是由于等電點(diǎn)附近時(shí)，蛋白質(zhì)分子所帶靜電荷少，分子間的靜電排斥作用減弱，蛋白質(zhì)更易發(fā)生聚集、沉淀現(xiàn)象[13]。

圖2 pH對(duì)燕麥蛋白酶解物溶解性的影響

2.3 燕麥蛋白酶解物乳化性和乳化穩(wěn)定性

pH對(duì)燕麥蛋白酶解物乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響如圖3和圖4所示。不同水解度的酶解物的乳化性和乳化穩(wěn)定性均高于未水解燕麥蛋白，這是由于蛋白質(zhì)乳化性與蛋白質(zhì)分子表面的疏水基團(tuán)及分子大小有關(guān)，隨著酶解反應(yīng)的進(jìn)行，燕麥蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，疏水基團(tuán)逐漸暴露，有利于與油滴的結(jié)合，從而提高了其乳化能力。隨著DH的增加，燕麥蛋白酶解物乳化性逐漸下降。這是因?yàn)槿榛磻?yīng)的作用機(jī)理是溶液吸附到油滴的表面，形成保護(hù)膜以防止液滴聚結(jié)。水解過(guò)程中的產(chǎn)物多數(shù)是小肽和氨基酸，盡管小肽在油水界面處吸附能力強(qiáng)，但不具有大分子蛋白質(zhì)的折疊力，它們不能像大分子蛋白質(zhì)一樣形成牢固的界面張力[14]。因此溶液的乳化性隨水解度提高而降低。燕麥蛋白經(jīng)過(guò)堿性蛋白酶水解后乳化活性隨pH呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢(shì)，等電點(diǎn)處乳化性最低；而乳化穩(wěn)定性的變化規(guī)律正好相反。乳化性和乳化穩(wěn)定性隨pH變化規(guī)律與李洋[5]的研究基本一致。這是因?yàn)樵诘入婞c(diǎn)處凈電荷為零，不存在同種電荷互斥，能促使高黏性膜的形成，利于乳狀液的穩(wěn)定性，同時(shí)等電點(diǎn)時(shí)溶解性最低，也使其乳化活性降低。

圖3 pH對(duì)燕麥蛋白酶解物乳化性的影響

圖4 pH對(duì)燕麥蛋白酶解物乳化穩(wěn)定性的影響

2.4 燕麥蛋白酶解物清除DPPH自由基活性

不同水解度的燕麥蛋白酶解物對(duì)DPPH自由基清除能力如圖5所示。由圖5可知，所有DH的酶解物對(duì)DPPH自由基都有清除作用，而且表現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)。未水解的燕麥蛋白對(duì)DPPH 自由基清除率幾乎為零，因此在圖中未標(biāo)明。通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析可以得出DH 5%、DH 10%、DH 15%和DH 20%的燕麥蛋白酶解物濃度與清除率的回歸方程分別為y=10.23x+24.066（R2=0.995 3），y=10.445x+21.546（R2=0.993 8），y=11.25x+20.596 6（R2=0.988 5），y=5.905 5x+20.71（R2=0.991 2）；其半抑制質(zhì)量濃度（IC50值）分別為6.274，6.145，6.050和5.640 mg·mL-1。即隨著DH增大，IC50值逐漸減小，說(shuō)明抗氧化活性逐漸增大。酶解物對(duì)DPPH自由基清除能力隨著DH的提高而增強(qiáng)。這可能由于隨著水解度增大，游離的疏水性氨基酸會(huì)不斷解離出來(lái)，酶解物的抗氧化活性與其疏水性氨基酸的種類和數(shù)量有關(guān)，因此在試驗(yàn)水解度范圍內(nèi)，抗氧化活性隨DH的增加而增大。

圖5 不同水解度的燕麥蛋白酶解物對(duì)DPPH自由基的清除率

3 結(jié)論

研究了水解度對(duì)燕麥蛋白酶解物功能特性和抗氧化活性的影響。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)堿性蛋白酶的限制水解作用較未作用的燕麥蛋白的功能性質(zhì)有了很大提高。燕麥蛋白酶解物的溶解度隨水解度增加而大幅提高，等電點(diǎn)處尤為明顯；乳化性隨水解度增加而降低，而乳化穩(wěn)定性的變化規(guī)律與乳化活性相反。酶解物對(duì)DPPH自由基清除活性隨著水解度增加而變大。

綜上所述，燕麥蛋白經(jīng)過(guò)限制性酶解作用，功能特性和抗氧化活性有了很大程度的提高，為今后燕麥蛋白及其酶解物在食品領(lǐng)域的研發(fā)及應(yīng)用提供了新的思路。