夏枯草果實石油醚提取物GC-MS分析及抗炎活性研究

李詩卉 鄧靜 粟倩 梁詩瑤 伊美瑾 林麗美 孫維廣

〔摘要〕 目的 表征夏枯草果實石油醚提取物化學成分，評價其抗炎活性。方法 采用氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）對夏枯草果實的化學成分進行分析。建立RAW264.7細胞炎癥模型，評價其抗炎效果。結果 共鑒定夏枯草果實石油醚提取物中19個化學成分。抗炎活性發現，夏枯草果實石油醚提取物均具有明顯的抗炎效果。結論 夏枯草果實石油醚提取物成分及抗炎活性均具一定差異性。

〔關鍵詞〕 夏枯草果實;石油醚提取物;氣相色譜-質譜聯用;抗炎

〔中圖分類號〕R284.1;R285.5 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.06.009

〔Abstract〕 Objective To characterize the chemical constituents of petroleum ether extract from prunella vulgaris L. fruit， and to evaluate its anti-inflammatory activity. Methods GC-MS was used to detect the chemical constituents of the fruits of prunella vulgaris L. The RAW264.7 cell inflammation model was established， and its anti-inflammatory effect was evaluated. Results A total of 19 chemical compounds were identified from Prunella vulgaris L. The research on anti-inflammatory activity found that the petroleum ether extracts of Prunella vulgaris L. had significant anti-inflammatory effects. Conclusion The costituents and anti-inflammatory activities of the petroleum ether extracts of Prunella vulgaris L. have certain differences.

〔Keywords〕 fruit of Prunella vulgaris L.; petroleum ether extract; GC-MS; anti-inflammatory

夏枯草（Prunella vulgaris L.）為唇形科夏枯草屬多年生草本植物，藥用部位為干燥果穗，具有清火、明目、散結等功效，其主要化學成分有揮發油類、多糖類、黃酮類、三萜類等[1-2]。夏枯草為藥食兩用大宗中藥材之一，是中成藥夏枯草膏、夏桑菊顆粒等最為重要的原料藥材，也是王老吉、夏桑菊飲料等涼茶的主要原料藥材，市場需求極大。藥用部位夏枯草果穗在入藥前，通常堆放在倉庫儲存，一段時間后果穗中的部分果實散落于地。待果穗入藥之后，通常會將散落地面的果實與塵土一起當成垃圾丟棄，造成資源的嚴重浪費。夏枯草果實是夏枯草果穗藥用部位的組成之一，夏枯草果穗的活性成分在果實部位中也有大量分布[3]。因此，本文選擇夏枯草果實為研究對象，首先進行其石油醚部位的提取，對提取部位采用GC-MS進行成分表征，采用體外炎癥模型對該提取部位進行活性評價，報道如下。

1 材料

1.1 ?原料

夏枯草采購于湖南長沙高橋藥材市場，經湖南中醫藥大學劉塔斯教授鑒定為唇形科夏枯草屬植物夏枯草Prunella vulgaris L.，取干燥夏枯草果實部分;小鼠巨噬細胞RAW 264.7來自中國科學院上海細胞庫。

1.2 ?主要試劑

無水乙醇、石油醚、甲醇、正己烷（國藥集團化學試劑有限公司）;濃硫酸（株洲市星空化玻試劑有限公司）;胎牛血清、DMEM高糖培養基、雙抗（鏈霉素、青霉素）、PBS磷酸緩沖液、胰蛋白酶（Hyclone公司）;噻唑藍、脂多糖、二甲基亞砜（Sigma公司）;細胞凍存液（NCM bioech）;小鼠TNF-α ELISA 試劑盒、小鼠IL-6 ELISA 試劑盒（聯科生物科技有限公司）;NO Griess 試劑盒（碧云天生物技術研究所）。

1.3 ?主要儀器

分析電子天平（奧多利斯科學儀器公司）;旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）;超純水機（蘇州賽恩斯儀器公司）;高速離心機（德國Eppendorf公司）;氣相色譜-質譜聯用儀（GC-MS，日本島津）;多功能酶標儀（Thermo公司）;熒光生物顯微鏡（日本OLYMUS）;單面凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司）;漩渦混軒逸（上海滬西分析儀器廠）;全自動細胞計數儀（美國Bio-Rad）。

2 方法

2.1 ?夏枯草果實石油醚提取物GC-MS指紋圖譜

2.1.1 ?石油醚提取物的提取 ?剝開夏枯草果穗取其干燥果實，粉碎后過60目篩。取干燥藥材粉末50 g，置于500 mL圓底燒瓶中，加入石油醚（b.p.60～90 ℃）300 mL浸泡1 h，加熱回流提取3次，每次2 h，合并提取液，減壓濃縮至油狀，所得石油醚提取物加入無水乙醇萃取，冷藏過夜分層，取上層液減壓濃縮除去乙醇，無水硫酸鈉干燥即得石油醚提取物[4]。

2.1.2 ?甲酯化前處理 ?10 mg石油醚提取物加

400 μL 1%硫酸-甲醇溶液，于70 ℃水浴鍋加熱30 min，加400 μL 正己烷和1 mL蒸餾水，混勻，靜置分層，取上清液進行GC-MS檢測[5]。

2.1.3 ?GC-MS分析條件 ?色譜柱：DB-5MS石英毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）;進樣量1 μL;柱溫：起始溫度80 ℃保持2 min，以20 ℃/min的速度升溫至160 ℃，再以8 ℃/min升溫至270 ℃，保持10 min。載氣：高純氦氣（99.999%）;流速1.0 mL/min;分流進樣，分流比10∶1;進樣口溫度280 ℃;電子轟擊離子源溫度200 ℃;溶劑延遲時間6.5 min;質譜掃描范圍m/z 35～550[6]。

2.2 ?抗炎能力測定

2.2.1 ?MTT法檢測細胞毒性 ?取對數生長期細胞，以每孔5×103個種于96孔板，每組設置6個復孔，于37 ℃、5% CO2培養箱孵育24 h。分為正常組、模型組、藥物組（濃度梯度為100.00、50.00、25.00、12.50、 6.25 μg/mL）。正常組與模型組加入100 μL細胞培養基，藥物組每孔給藥100 μL，藥物組的每個濃度設置6個復孔，給藥2 h后藥物組與模型組加入100 μL 0.1 μg/mL的脂多糖，孵育24 h后每孔加入噻唑藍，4 h后每孔加入150 μL二甲基亞砜搖床避光低速振蕩15 min。酶聯免疫檢測儀于490 nm測量吸光值A，計算細胞存活率[7-8]。

2.2.2 ?炎癥因子含量檢測 ?各組細胞上清液經300×g離心10 min，收集上清。按照ELISA與Griess試劑盒說明書對IL-6、TNF-α及NO含量進行測定[9-11]。

3 結果

3.1 ?GC-MS測定結果

3.1.1 ?提取率 ?根據“2.1.1”石油醚提取物的提取方法得到夏枯草果實石油醚提取物，夏枯草果實得到石油醚提取物3.0 g，其提取率為6.0%。

3.1.2 ?成分分析 ?對夏枯草果實石油醚提取物GC-MS數據分析，得到夏枯草果實石油醚提取物主要成分為脂肪酸，共鑒定出19種化學成分，分別為2-十二烯基-1-琥珀酸酐、壬醛二甲基縮醛、肉豆蔻酸、9-十六烯酸、十六烷酸、亞麻酸、硬脂酸、亞油酸乙酯、11，13-二十碳二烯酸、順11-二十烯酸、十八甲基癸酸、13-二十二碳烯酸、二十二烷酸、15-十四烯酸、二十四烷酸、角鯊烯、4，4，6a，6b，8a，11，11，14b-Octamethyl-1，4，4a，5，6，6a，6b，7，8，8a，9，10，11，12，12a，14，14a，14b-octadecahydro-2H-picen-3-one、己二酸、β-生育酚。見表1和圖1。

3.2 ?抗炎能力測定結果

3.2.1 ?藥物濃度篩選 ?取不同濃度（100.00、50.00、25.00、12.50、6.25 μg/mL）夏枯草果實石油醚提取物刺激小鼠巨噬細胞，實驗結果顯示藥物濃度小于25 μg/mL時基本無細胞毒性，即小于25.00 μg/mL為藥物的最佳濃度范圍。見圖2。

3.2.2 ?藥物對LPS誘導RAW264.7細胞分泌IL-6、TNF-α及NO的影響 ?在藥物的最佳濃度范圍選擇3個濃度，即25.00、12.50、6.25 μg/mL，收集3個濃度上清液進行炎性因子檢測。由圖3可知，模型組細胞培養液中IL-6、TNF-α含量與正常組具有非常顯著性差異（P<0.01），NO含量與正常組具有顯著性差異（P<0.05）。將樣品與模型組進行比較，藥物組與模型組在3個炎性因子表達比較中大多具非常顯著性差異（P<0.01），說明夏枯草果實石油醚提取物可顯著抑制由LPS誘導RAW264.7細胞分泌的IL-6、TNF-α及NO炎性因子。見圖3。

4 討論

夏枯草以果穗入藥前需曬干，在曬干過程中，大量果實散落于地上，通常這些果實與塵土一起當成垃圾丟棄，造成資源浪費。有研究[3]表明夏枯草果實的抗氧化活性比果穗高，為了進一步利用夏枯草藥用部位資源，對夏枯草果實進行成分表征和活性評價顯得尤為重要。本研究以夏枯草果實石油醚提取物為研究對象，對其化學成分進行表征，且進行抗炎活性研究。夏枯草果實得到石油醚提取物3.0 g，石油醚提取物提取率為6.0%。通過GC-MS檢測，得到夏枯草果實石油醚提取物主要成分為脂肪酸，共鑒定出19種化學成分，分別為2-十二烯基-1-琥珀酸酐、壬醛二甲基縮醛、肉豆蔻酸、9-十六烯酸、十六烷酸、亞麻酸、硬脂酸、亞油酸乙酯、11，13-二十碳二烯酸、順11-二十烯酸、十八甲基癸酸、13-二十二碳烯酸、二十二烷酸、15-十四烯酸、二十四烷酸、角鯊烯、4，4，6a，6b，8a，11，11，14b-Octamethyl-1，4，4a，5，6，6a，6b，7，8，8a，9，10，11，12，12a，14，14a，14b-octadecahydro-2H-picen-3-one、己二酸、β-生育酚。采用LPS誘導RAW264.7細胞建立炎癥模型，檢測夏枯草果實石油醚提取物的抗炎效果，夏枯草果實石油醚提取物能顯著抑制由LPS誘導RAW264.7細胞分泌的IL-6、TNF-α及NO炎性因子，具有較好的抗炎效果。

由于實驗收集的夏枯草樣本有限，且還存在不同年限、存儲時間等的影響，因此，課題組擬進一步擴大樣本量，采用體內外炎癥模型結合譜效相關性，探索和驗證夏枯草果實石油醚提取物得率、成分及活性，以期為夏枯草果實的進一步開發提供依據。

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