血清miRNA-195作為帕金森病潛在生物學標記物的初步研究

陳子旋?朱麗娜?劉雯?解孝艷　楊厲穎　周靜雯　徐將　劉姜冰　王英歌　唐向明

【摘要】背景近年來有研究表明血清微小RNA（microRNA，miRNA）可作為疾病生物學標志物，有助于疾病的發病風險評估、早期診斷以及監測治療效果和預后。本研究對一種血清miRNA與帕金森病（PD）相關性進行探究，力求尋找PD早期診斷可能的生物學標志物。 目的 研究末梢血清miRNA作為帕金森病生物標志物的潛力。 方法 采集36例PD患者和36例健康體檢者血清標本，通過RT-qPCR檢測血清內miR-195的表達。收集211例PD患者和113例健康人臨床資料進行統計分析。結果與健康體檢者相比，PD患者血清miR-195表達水平明顯上調。臨床統計資料分析顯示吸煙、糖尿病與PD發病呈負相關，高血壓可能與PD發病呈正相關，PD病人伴有外周血紅細胞及血紅蛋白量降低。

【關鍵詞】帕金森病（PD）;血清;miRNA;生物標記物;危險因素

【中圖分類號】R37 【文獻標識碼】A 【文章編號】ISSN.2095.6681.2020.18..02

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是一種常見于中老年人的神經系統退行性病變，以腦內黑質多巴胺能神經元進行性缺失為病理特征。PD臨床運動癥狀有靜止性震顫、運動遲緩、肌強直以及姿勢步態障礙等，非運動癥狀包括認知障礙、嗅覺喪失、便秘等。多數患者的非運動癥狀較運動癥狀出現早，PD的診斷主要依賴于臨床運動癥狀。影像學早期無典型特征[1]，缺乏特異性生物學標志物，導致PD早期診斷困難。所以尋找特異性較高的生物學標記物是PD早期診斷的重要問題。為尋找PD早期診斷的生物學標記物，大量學者對腦脊液，血漿，血清，唾液，尿液，皮膚等組織標本進行基因測序，發現血清中循環RNA作為生物學標記物具有優勢。盡管大量研究對PD患者血清中miRNA進行探索，結果卻存在異質性。Aghili[2]制作出miR-195電化學納米生物傳感器用于早期診斷PD，其敏感性和特異性需進一步證實。本研究旨在探索外周循環血清miR-195與PD發病的相關性，為PD的早期識別提供實驗依據。

1 材料與方法

本實驗自2018年5月～2019年10月收集揚州大學附屬醫院72個漢族個體血液，所有受試者均已簽署知情同意書。帕金森病的診斷依據典型臨床癥狀和體征以及影像學確診，主要排除標準包括PD病人合并腫瘤、惡液質、全身或中樞神經系統嚴重感染;伴有心、肝、腎或其他臟器嚴重疾病的病史。另收集211個帕金森患者和113個正常體檢者的臨床資料進行分析。這項研究得到了揚州大學附屬醫院倫理委員會的批準。

采集空腹安靜狀態下PD病人和健康者血液，離心取上清液至-80°C貯存。使用miRNA提取分離試劑盒（北京天根）提取小分子RNA。血清中提取出的RNA使用miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑進行逆轉錄。反應液可于-20°C保存。進行下游熒光定量檢測前，將cDNA反應液加入4倍DEPC水稀釋使用。使用miRcute增強型miRNA熒光定量檢測試劑盒（北京天根）、SYBR、miR-195引物和內參U6，配置20ul體系試劑，使用熒光定量聚合酶鏈反應儀（羅氏LightCycler480）檢測。樣本一式兩份進行，最終miRNA表達量計算為2-ΔΔCt。

2 統計分析

使用統計產品SPSS16.0版進行統計分析，實驗中miR-195表達量通過獨立t檢驗，臨床數據通過x2檢驗和獨立t檢驗進行分析。

3 結 果

實驗測量和分析了miRNA-195（CT值，7.296±1.42774）的相對表達量。統計學分析發現PD病人血清中miRNA-195（P=0.001）表達量明顯高于健康人，結果具有統計學意義。臨床收集的211例PD患者中，男性121例，女性90例，年齡處于72.76±8.47歲。臨床數據結果由表可知高血壓可促進PD進展，糖尿病、吸煙不增加PD的發病風險。PD患者較健康人群外周血紅細胞和血紅蛋白含量降低。見下表

4 討 論

目前大部分神經系統疾病的診斷主要依靠臨床癥狀和影像學檢查，這使得該類疾病的早期防治策略的開發受到限制。目前已發現多種血清miRNAs可作為PD診斷的生物學標記物。Barbagallo等人[3]對139例神經退行性疾病患者和健康人血清中23種miRNAs檢測發現，部分miRNAs的分泌具有特異性，從而可用于神經退行性疾病的無創診斷。本研究測得miR-195在PD患者血清表達上調，與馬文斌[4]，曹向陽[5]研究結果一致。Aghili等人[2]制作出miR-195電化學納米生物傳感器用于早期診斷PD，本實驗進一步證明其可行性。本研究具有一定的局限性，收集血清樣本均來自漢族72位個體，是否適用于其他種族仍需進一步探究，且樣本量有待進一步擴大。

本研究發現糖尿病、吸煙與PD發病呈負相關，這與夏虹等人[6]使用meta分析結果一致。腦內胰島素調節受損與多巴胺轉運體基因表達改變具有相關性[7]，這為糖尿病在PD中的不同作用提供了依據。高血壓與PD的發生發展密不可分。實驗室結果證明PD患者血中紅細胞和血紅蛋白數量減低。目前有研究提示鐵代謝紊亂造成的貧血可作為促進PD病理進展的危險因素，而外周血中高氧化應激狀態和紅細胞內α-突觸核蛋白的聚集可能加重對外周血紅細胞的破壞作用[8]。

miRNA作為PD早期識別生物學標志物的臨床意義包括阻礙和延緩癥狀的發生，前移PD康復治療的時間窗，幫助病人做到提前干預，在指導康復治療中起到輔助作用。盡管血清中的一些microRNAs可以作為潛在的帕金森病生物學標記物，但距離應用于臨床診斷仍有很大距離。目前臨床對早期帕金森病的誤診率高達25%，多在神經元損傷后5～15年內方可確診，臨床更多目光聚焦于帕金森病的康復治療。目前康復治療方法多種多樣，但均需要針對個別患者特征制定不同的康復計劃。運動影像和動作觀察療法、虛擬現實、耐力運動訓練、力量訓練，有氧訓練和物理療法被認為是有前途的PD康復方法。另外，負責神經功能障礙康復的Lokomat機器人常應用于帕金森疾病康復治療，使患者運動能力得到改善[9][10][11]。隨著科技和醫療的發展，PD的康復治療將會有更多的進展，這也將為PD患者帶來更多有效的治療方案。

5 結 論

血清miRNA-195可能作為帕金森病診斷的生物學標記物，目前需要更多的研究來證實。吸煙、糖尿病與PD發病呈負相關，高血壓、貧血是PD發生的危險因素。帕金森病無法達到治愈目的，臨床注重PD患者的康復治療。

參考文獻

[1] 賀志明，黃月明.帕金森病的診斷和治療進展[J].邵陽學院學報（自然科學版），2019，16（06）：90-94.

[2] Aghili Z，Nasirizadeh N， Divsalar A，et al. A highly sensitive miR-195 nanobiosensor for early detection of Parkinson's disease. Artif Cells Nanomed Biotechnol.2018;46（sup1）：32‐40.

[3] Barbagallo C， Mostile G， Baglieri G， et al. Specific Signatures of Serum miRNAs as Potential Biomarkers to Discriminate Clinically Similar Neurodegenerative and Vascular-Related Diseases. Cell Mol Neurobiol. 2020;40（4）：531‐546.

[4] Ma W， Li Y， Wang C， Xu F， et al. Serum miR-221 serves as a biomarker for Parkinson's disease. Cell Biochem Funct. 2016;34（7）：511‐515.

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[11] 夏 敏，詹增土，蔡國恩等.帕金森病患者全自動下肢機器人訓練前后的三維步態分析[J].中華神經科雜志，2018，51（07）：504-509.