圍產期孕婦B群鏈球菌三種篩查方法的評估

張昭勇，楊宏偉，張吉才

B群鏈球菌(group B streptococcus, GBS)又名無乳鏈球菌，是一種共生的革蘭陽性細菌，常定植于人體的直腸和泌尿生殖道。圍產期孕婦生殖道或直腸定植的GBS可以在分娩期間垂直傳播，常引起新生兒GBS感染。據報道，全世界大約18%的孕婦發生陰道直腸GBS定植，不同地區定植率從13%～35%不等[1]。國內報道圍產期孕婦GBS定植率約9.06%，提示準確檢測GBS至關重要，因為產時抗生素的使用可以顯著減少新生兒GBS感染[2]。

圍產期孕婦GBS篩查正受到全世界的高度重視，2010年美國疾病預防控制中心(centers for disease control and prevention，CDC)修訂了“預防圍產期B組鏈球菌疾病指南”，建議對35～37周圍產期孕婦進行GBS定植篩查[3]，我國“孕前和孕期保健指南(2011年)”也對此篩查進行了推薦。目前GBS篩查方法包括細菌培養、免疫層析和分子生物學等。雖然傳統細菌培養法具有敏感性高、特異性強的特點，但是耗時耗力，專業技術要求高；免疫層析法操作方便簡單，半小時內可以出結果，但是敏感性和特異性存在不足[4]。Xpert GBS LB系統是一種全新的快速檢測GBS的全自動一體化半定量巢式實時聚合酶鏈式反應系統，可以在2 h內快速對樣本進行核酸提取、純化及濃縮檢測。該系統可直接檢測標本，也可對增菌或分離后的標本進行檢測，有報道稱其敏感性較顯色肉湯增菌培養法提高10%～15%[5]。為了對上述GBS篩查方法進行合理評估，筆者對1063份圍產期孕婦生殖道或直腸標本進行同時檢測，以顯色肉湯增菌培養法作為GBS篩查的“金標準”，對Xpert GBS LB法、免疫層析法和普通培養法進行診斷效能評價。

1 材料與方法

1.1研究對象 選取2019年4—6月湖北醫藥學院附屬醫院產科門診行GBS篩查圍產期孕婦(35～37周)1063例,年齡21～43(26.8±12.98)歲。

1.2儀器與試劑 美國賽沛GeneXpert Dx System及Xpert GBS LB試劑盒，DL-GBS 96培養分析系統及鏈球菌選擇性顯色肉湯培養基(珠海迪爾生物有限公司提供)，哥倫比亞血瓊脂平板，DL-96細菌鑒定系統及鑒定板，GBS膠體金快速檢測試劑盒購自廣州輝康生物科技有限公司。

1.3標本采集及檢測方法

1.3.1標本采集：由產科醫師采集孕35～37周孕婦陰道(897例)或直腸(166例)拭子標本于運輸培養基中立即送檢。

1.3.2Xpert GBS LB檢測：取采集標本棉簽于樣本處理液中充分混勻，震蕩后室溫孵育15 min，取2 ml上清液加入檢測試劑盒并加載到GeneXpert Dx System，大約2 h內自動完成GBS檢測。

1.3.3GBS普通培養及顯色肉湯增菌培養：GBS普通培養：取采集標本棉簽接種哥倫比亞血瓊脂平板，35℃、5% CO2孵育18～24 h后，挑取可疑菌落革蘭染色陽性、觸酶陰性初步鑒定后，進行CAMP試驗和DL-96細菌檢測系統鑒定。GBS顯色肉湯增菌培養：取GBS選擇性顯色培養基置室溫平衡，將稀釋液倒入凍干粉中，混勻溶解，將采集的標本拭子插入培養瓶充分洗脫標本，然后加封1.5 ml礦物油，旋緊蓋子，放置DL-GBS 96培養分析系統，8～48 h自動報告結果。

1.3.4GBS免疫層析法檢測：取1、2號抽提液各5滴，混勻；將采集標本棉簽插入充分洗脫標本，取出3滴混合洗脫液，加入樣品孔內；放置8～10 min后讀取結果。陽性為在質控區與測試區同時出現紅線；陰性：質控區出現紅線，測試區不出現紅線；無效：質控區不出現紅線。

1.4統計學方法

1.4.1樣本含量估算：估計該試驗敏感度為85%，特異性為80%，設允許誤差Δ=0.10，α=0.05，Zα=1.96(雙側)。則病例組樣本量=1.962×0.90×(1-0.90)/0.102=49；對照組樣本量=1.962×0.80×(1-0.80)/0.102=92，研究樣本多于最少估計例數，具有研究意義。

1.4.2一致性檢驗：Kappa一致性檢驗評價不同檢測方法的一致性，當κ<0表示一致性強度極差，當κ為0～0.20時表示一致性強度微弱，當κ為0.21～0.40時表示一致性強度弱，當κ為0.41～0.60時表示一致性強度中度，當κ為0.61～0.80時表示一致性強度高度，當κ為0.81～1.00時表示一致性強度極強。Kappa值的假設檢驗，U>1.96、P<0.05可認為兩種測定方法結果具有一致性[6]。

1.4.3診斷試驗評價：以顯色肉湯增菌培養法為“金標準”，計算3種篩查方法的敏感性、特異性、陰/陽性預測值等性能指標。χ2檢驗比較不同方法的陽性檢出率，以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.13種GBS篩查方法檢測結果及一致性比較 與顯色肉湯增菌培養法比較，Xpert GBS LB法和普通培養法具有極強的一致性，免疫層析法僅具有中度一致性，見表1。

表1 3種GBS篩查方法檢測結果及一致性比較

2.2不同GBS篩查方法陽性檢出率比較 與“金標準”顯色肉湯增菌培養法比較，Xpert GBS LB和免疫層析法檢出率差異具有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，普通培養法檢出率差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 不同GBS篩查方法陽性檢出率比較

2.33種GBS篩查方法診斷效能評價 3種篩選方法中，普通培養法特異性最高，Xpert GBS LB敏感性最高，而免疫層析法的敏感性和特異性均較差，見表3。

表3 3種GBS篩查方法診斷效能評價

3 討論

20世紀70年代，GBS感染成為美國新生兒發病率和病死率升高的主要原因，最初報告顯示病死率高達50%。母親泌尿生殖道或胃腸道中GBS定植是該類疾病的主要危險因素，一項經典的前瞻性隊列研究表明，GBS生殖道定植的孕婦較GBS培養陰性孕婦發生新生兒GBS感染的可能性高25倍以上[7]。因此，圍產期孕婦GBS篩查和產前抗生素的預防成為降低新生兒GBS感染率和病死率的重要措施[8-9]。自2002年美國CDC指南發布以來，細菌培養已成為圍產期孕婦GBS篩查的“金標準”。由于傳統培養法敏感性較低，2010年美國CDC指南將顯色肉湯增菌培養法推薦為GBS定植篩查的“金標準”。雖然基于培養的GBS篩查極大降低了新生兒GBS感染相關疾病的發病率和病死率，但是培養法對人員素質的高要求和速度較慢的特點已無法滿足臨床快速篩查的需求[10]。鑒于傳統培養法的固有缺點，臨床亟需一種快速、靈敏、高特異性的新型篩查方法。目前針對GBS快速篩查方法主要包括免疫層析法和Xpert GBS LB法，對這些新型方法篩查效能進行合理評估有利于臨床做出合理選擇。

Xpert GBS LB系統是一種全新的快速檢測GBS的全自動一體化半定量巢式實時聚合酶鏈式反應系統，主要通過檢測GBS cfb基因區域從而對細菌進行鑒定。該系統可以在2 h內快速對樣本進行核酸提取、純化及濃縮檢測。Xpert GBS LB法可直接檢測標本，也可對增菌或分離后的標本進行檢測，試驗的檢測極限報告為131 cfu/ml。GBS普通培養法檢測極限為10～100 cfu/ml，但在本研究中其敏感性低于Xpert GBS LB法。Xpert GBS LB法較高敏感性的原因包括：通過檢測死亡細菌細胞中的殘留DNA而得到增強，而培養標本未能及時處理和可能導致部分活菌死亡使得培養敏感性下降；鑒定了培養物中遺漏的非β-溶血性GBS。Xpert GBS LB法可出現假陰性結果，其原因可能是GBS cfb基因區域染色體缺失所致[11-12]。本研究中Xpert GBS LB法高敏感性證明了使用分子方法檢測GBS可有效提高圍產期孕婦攜帶者的檢出率，從而可能進一步降低早發性GBS感染的發生率。

GBS免疫層析法是通過標記的單克隆抗體與GBS抗原特異性結合形成抗原抗體復合物,而被固相多克隆抗體捕捉呈現紅色色帶即陽性。臨床分離的GBS特異性莢膜多糖類型繁多，已知的血清型多達十余種，即Ia、Ib、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ型。因此，使用莢膜多糖作為抗原靶標可能使情況變得十分復雜，與GBS親緣關系較近的A群、草綠色鏈球菌均可能導致假陽性的產生[13-14]。本研究中免疫層析法雖然陽性檢出率為24.55%，但是其中10.15%為假陽性結果，主要原因是生殖道或腸道正常菌群復雜引起的交叉反應導致。在3種檢測方法中，免疫層析法的一致性最差，這提示我們對該方法需要尋找更加特異的抗原抗體。雖然免疫層析法的敏感性和特異性均存在一定的不足，但是該法簡便易操作，對檢驗人員要求低，可以在比較簡單的實驗室開展，因此是基層醫院可行的一種方法。

普通培養法既往長期作為GBS篩查的“金標準”，敏感性過低是其主要缺點。在我們的研究中也發現普通培養法的陽性檢出率最低。普通培養法的另外一個缺點是操作煩瑣，需24 h或更長時間才能獲得培養結果，并且需要專業的微生物人員才能完成[15]。當孕婦攜帶的病原菌負荷比較低或接種標本量不足可導致假陰性結果的出現。其次，臨床約5%的非β-溶血性GBS可能被檢驗人員認為是草綠色鏈球菌丟棄而漏診。但是，普通培養法與顯色肉湯增菌培養法一致性及診斷特異性高為臨床所認可，特別是能夠為臨床提供完善的藥物敏感性結果，并且可以監測定植菌株的耐藥變遷，因此是臨床不可或缺的重要環節[16]。

總之，臨床常用的3種GBS篩查方法，與臨床“金標準”顯色肉湯增菌培養法比較，Xpert GBS LB法和普通培養法具有很高的一致性，免疫層析法僅具有中度一致性。3種方法各有優劣點，免疫層析法操作簡單易行，適合于基層醫療機構開展；普通培養法特異性高，可以為臨床提供全面的篩查和藥物敏感性結果；Xpert GBS LB法在檢測效能上優于免疫層析法和普通培養法，可有效提高圍產期孕婦GBS感染檢出率，降低早發性GBS感染發生率。