腎動脈移植骨髓間充質干細胞對阿霉素腎病大鼠腎纖維化的影響

楊 揚， 王家平， 萬珊杉， 李天祎， 楊素萍

慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）患病率逐年增高，調查顯示全球總患病率為10.8%，我國就有約1.195億CKD患者［1］。CKD是由多種原發性或繼發性腎臟疾病持續性發展而來，隨著病程進展，出現腎小球硬化及腎間質纖維化病理改變，臨床上表現為腎小球濾過率進行性下降，尿蛋白顯著增加，最終腎衰竭，治療方式僅為透析或腎臟移植，手段有限。骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC）作為再生醫學中修復損傷組織和臟器的種子細胞，能夠靶向歸巢至受損組織及炎癥部位，通過直接分化為腎臟固有細胞、旁分泌多種細胞因子促進血管再生，減少足細胞損傷并延緩腎臟纖維化，對受損腎組織發揮積極的修復作用［2-5］。然而不同的BMSC移植途徑將直接影響其歸巢至受損腎組織的數量，從而影響其對受損腎臟的修復作用。本研究旨在評估經腎動脈移植BMSC對阿霉素腎病大鼠受損腎組織的修復作用及對腎臟纖維化的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

50只清潔級雄性Sprague-Dawley大鼠由昆明醫科大學動物中心提供。2只為4周齡，用于體外分離培養BMSC；48只16周齡，用作實驗分組，體質量（356±18）g，其中36只用于構建CKD動物模型，12只為正常對照組。主要試劑：胎牛血清（FBS）和低糖培養基（L-DMEM）（美國Gibco公司），阿霉素（美國Sigma公司），青鏈霉素雙抗和0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）消化液（北京索萊寶科技公司）。

1.2 阿霉素慢性腎病動物模型構建和實驗分組

購進大鼠后適應性喂養1周，期間予以自由飲食。固定大鼠，經尾靜脈注射阿霉素，第1次劑量為3 mg/kg，間歇14～20 d予以相同劑量第2次注射，之后每周尾靜脈采血測血肌酐、血尿素氮水平，收集24 h尿液檢測24 h尿蛋白含量，以血肌酐、血尿素氮和24 h尿蛋白水平升高，腎臟病理切片蘇木精-伊紅（HE）染色示慢性腎病改變為造模成功標準，平均時間約為7周。將造模成功大鼠隨機分為3個組：模型組（CKD組）、經尾靜脈移植BMSC組（V-M組）和經腎動脈移植BMSC組（A-M組），每組各12只；剩余12只健康大鼠為正常對照組（N組），經尾靜脈輸注等量0.9%氯化鈉溶液。

1.3 BMSC體外分離培養

采用全骨髓貼壁培養法分離純化大鼠BMSC。2只4周齡清潔級SD大鼠，體質量80 g，脫頸處死，75%乙醇全身浸泡10 min，0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈；超凈工作臺下取雙側股骨、脛骨，剔除肌肉等組織，剪去骨骺端，暴露骨髓腔，用5 mL注射器抽取磷酸緩沖液（PBS）沖洗骨髓腔3～5次，直至觀察到骨髓腔變白；收集骨髓腔沖洗液于離心管中，充分吹打混勻，100 μm細胞篩過濾后，1 500 r/min離心5 min，輕輕倒去 PBS，用含 10%FBS、1%青鏈霉素雙抗的L-DMEM重懸細胞，再次充分吹打混勻，制成單細胞懸液，接種至T25細胞培養瓶中，置于37℃、5%CO2細胞培養箱中孵育；48 h后首次換液，以后每隔3 d換液1次。待細胞生長融合達90%～100%時，用 0.25%胰蛋白酶-EDTA 消化細胞，按 1∶4比例傳代。取P3代細胞進行成骨、成脂誘導分化培養，流式細胞儀行細胞表面抗原鑒定。

1.4 不同途徑移植BMSC

將生長狀態良好、融合度達100%的BMSC用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，倒置相差顯微鏡下見細胞呈圓形后加入L-DMEM培養基終止消化，1 500 r/min離心5 min，棄上清液，PBS重懸細胞，充分吹打混勻制成單細胞懸液，細胞計數器計數細胞，調整單細胞懸液成2×106個/mL，冰盒保存備用。A-M 組大鼠：10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，仰臥位固定于手術臺，剃除頸部毛發，聚維酮碘消毒，鋪無菌手術單；充分暴露頸部，正中做約4 cm垂直切口，鈍性分離出左頸總動脈，眼科剪在左頸總動脈作T字型切口，參照文獻［6］方法插入PE10導管，DSA下動態觀察，直至導管推送至右腎動脈，注射少量對比劑證實后推注500 μL BMSC懸液；術畢結扎左頸總動脈，逐層縫合頸部手術切口，肌內注射抗生素預防感染，將大鼠放置保溫箱中，密切觀察，待其自然清醒后歸籠繼續飼養。

V-M組大鼠：經尾靜脈注射等量BMSC懸液。CKD組大鼠：經尾靜脈注射等量PBS。N組大鼠：經尾靜脈注射等量0.9%氯化鈉溶液。

1.5 樣本收集與檢測

分別于移植BMSC后第7、14天，將各組大鼠放入代謝籠內，收集24 h尿液，尾靜脈采血分離血清；采用Chemray 240型全自動生化分析儀檢測24 h尿蛋白、血肌酐和血尿素氮水平。移植BMSC后第14天處死各組大鼠，快速取腎，固定脫水后制成5 μm石蠟切片，行HE染色和Masson三色染色，觀察腎臟結構病理改變及纖維化情況。纖維化評分標準：根據病變由輕至重程度，依次半定量評估，極少量或無病變為“-”記 0，輕度或少量“+”記 1，中度或中等量“++”記 2，重度或多量“+++”記 3，極重度或大量“++++”記 4。

1.6 統計學方法

采用SPSS 23.0軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（x±s）表示，組間比較用重復測量資料方差分析，兩兩比較用最小顯著性差異t檢驗，檢驗水準 α=0.05。

2 結果

2.1 BMSC 分離、純化和鑒定

倒置相差顯微鏡下見大鼠BMSC呈多角形、梭形，“魚群狀”或“旋渦狀”貼壁生長。成骨誘導培養28 d后行茜素紅染色，可見被染成橘紅色的鈣結節；成脂誘導培養20 d后行油紅O染色，可見被染成紅色的脂滴（圖 1）。P3代 BMSC表面抗原CD11b、CD45、CD29、CD90 表達率分別為 2.23%、1.94%、99.98%、99.97%。

圖1 倒置相差顯微鏡下大鼠P3代BMSC及誘導分化培養結果

2.2 BMSC移植治療結果

與N組相比，CKD組、V-M組、A-M組血肌酐、血尿素氮、24 h尿蛋白均顯著升高（P＜0.01）。 移植BMSC后第7天，與CKD組比較，V-M組、A-M組24 h尿蛋白均降低（P＜0.05），且 A-M 組低于 V-M組（P＜0.05）；V-M 組血肌酐、血尿素氮與 CKD 組相比無明顯改善，但A-M組較CKD組改善明顯（P＜0.01）。 移植 BMSC后第 14天，V-M 組血肌酐、血尿素氮較CKD組有所下降，差異無統計學意義（P＞0.05），但 A-M 組與 V-M 組、CKD 組相比下降明顯 （P＜0.05）；V-M 組、A-M 組 24 h尿蛋白水平仍低于 CKD 組，但差異無統計學意義（P＞0.05）（表 1）。

2.3 腎組織HE染色和Masson三色染色結果

N組腎組織HE染色未見明顯病理改變，腎小球大小和形態均一、正常，基底膜正常，間質無炎性細胞浸潤，腎小管無萎縮；Masson三色染色未見膠原纖維沉積，評分0分。CKD組HE染色見大量腎小管間質炎性細胞浸潤伴結締組織增生，腎小管萎縮，管腔變小，基底膜增厚，腎小囊腔擴張，大量腎小球損傷，毛細血管擴張并出現空泡、系膜增厚、細胞減少，呈局灶節段性硬化改變；Masson三色染色見大面積腎小管間質及腎小球囊周圍膠原增生，纖維化評分為3分。V-M組HE染色見較多腎小管間質炎性細胞浸潤伴結締組織增生，腎小管擴張，上皮細胞扁平化，腔內充滿蛋白液，形成腎小管管型，部分腎小管萎縮，基底膜增厚，個別腎小球壞死；Masson三色染色見腎小管間質纖維增生，評分為2分。A-M組HE染色見少量腎小管間質炎性細胞浸潤伴少量結締組織增生，部分腎小球出現囊腔擴張，空泡變性及毛細血管擴張程度下降，腎小管萎縮數量減少，基底膜存在不同程度增生，少量腎小管內充滿嗜酸性蛋白液形成管型；Masson三色染色可見少量藍色著染膠原纖維，評分為1分，見圖2。

表1 移植BMSC后各組大鼠血肌酐、血尿素氮、24 h尿蛋白值比較 n=12

圖2 各組大鼠腎臟HE染色和Masson三色染色病理圖片（×200）

3 討論

阿霉素經注射后主要累積在腎臟，氧化后產生大量氧自由基，在多種活化因子作用下能誘導腎小球上皮細胞損傷，破壞濾過膜，從而造成腎臟損傷。這是經典的腎病模型構建方法。根據造模時間和給藥次數不同，可分為急性腎病模型和慢性腎病模型［7］。急性腎病模型造模時間較短，單次大量注射阿霉素后4周左右即可成模型，病理類型為微小病變型腎病，類似人類腎病綜合征；慢性腎病模型造模時間相對較長（＞5周），且需多次給藥，病理類型為局灶節段性腎小球硬化型腎病，類似人類慢性腎小球腎炎。值得注意的是，阿霉素亦對其他臟器有強烈的毒性作用和不良反應，實驗過程中引起造模大鼠死亡的原因主要有胃腸出血、腸脹氣、腹水、心肌損傷及肺腫瘤等［8］，這與給藥劑量和給藥間歇時間密切相關。本研究中采用尾靜脈注射阿霉素造模，首次劑量為3 mg/kg，間歇14～20 d以相同劑量再次給藥，約7周成功建立CKD模型。與大劑量（＞4 mg）、間歇1周再次給藥的造模方法相比，在造模時間相近前提下，顯著降低了大鼠死亡率，有效保證了實驗動物數量，而與單側腎切除聯合阿霉素注射法相比，該法操作簡單，效率較高。

目前，BMSC已被證實對慢性腎病確有一定的治療作用，但具體機制尚不清楚。研究表明，注射BMSC能顯著改善CKD大鼠腎功能，腎臟損傷程度較小的2/3腎切除組治療效果優于損傷程度重的5/6腎切除組，經BMSC處理后巨噬細胞（ED-1陽性細胞）數、α-平滑肌肌動蛋白（SMA）及增殖細胞核抗原（PCNA）表達顯著降低（P＜0.01），Masson 染色示腎間質纖維化和腎小球硬化程度下降，提示早期進行 BMSC干預 CKD大鼠治療效果更優［9］。Villanueva等［10］等研究結果與上述研究一致，不同的是其采用尾靜脈單次移植BMSC，結果表明BMSC可增強腎臟修復過程，顯著改善腎功能，并發現血管生成標志物血管內皮細胞生長因子（VEGF）和血管生成素家族受體Tie-2表達增加，推測BMSC對CKD受損腎組織的修復作用可能與誘導腎血管生成途徑有關。白彝華等［11］通過頸動脈腎動脈插管輸注BMSC至阿霉素CKD大鼠受損腎組織，發現血肌酐、尿素氮明顯下降，血紅蛋白顯著升高，腎臟HE染色示BMSC處理組大鼠腎組織中炎性細胞浸潤程度下降、范圍減小，提示經腎動脈移植BMSC有助于CKD腎組織修復。上述研究均表明BMSC對CKD具有治療作用，觀察指標主要是腎功能測定，如血肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白、血清白蛋白等變化，而與CKD疾病后期發展至腎臟纖維化有關的文獻報道并不多。本研究通過對比尾靜脈和腎動脈兩種途徑移植BMSC治療阿霉素CKD大鼠發現，兩種途徑均對受損腎組織發揮修復治療作用，移植后第7天V-M組、A-M組24 h尿蛋白與CKD組比較均降低（P＜0.05），且A-M組低于V-M組（P＜0.01），一直至第14天 A-M組、V-M組24 h尿蛋白水平仍低于CKD組；A-M組血肌酐、尿素氮水平較CKD組、V-M組下降，說明在移植BMSC后一段時間內，經腎動脈移植BMSC對CKD大鼠治療效果優于經尾靜脈移植；各組大鼠腎臟HE染色和Masson三色染色分析發現，BMSC干預可減少CKD大鼠腎組織炎性細胞浸潤，萎縮腎小管數量減少，擴張腎小管趨于正常，基底膜雖然仍存在不同程度增生，但與CKD組相比，BMSC干預后情況有所改善；隨著病程延長，大鼠腎纖維化程度加深，主要表現為腎間質纖維化和腎小球硬化，Masson染色見CKD組腎組織出現大面積藍染物質沉積于腎間質和腎小球囊周圍，而移植BMSC后發現腎組織中藍染面積縮小，著色程度減輕，說明BMSC移植治療能減輕或延緩CKD大鼠腎臟纖維化，修復腎組織。

綜上所述，BMSC移植療法可修復CKD大鼠受損腎組織，且在一定時間內，腎動脈途徑移植治療效果要優于尾靜脈途徑，可能與干細胞歸巢至腎組織數量有關［6］。此外，BMSC可抑制或延緩腎臟纖維化，并發揮積極的治療作用，但具體作用機制尚不清楚。有研究提出細胞外基質（extracellular matrix，ECM）過度沉積，可能是導致腎間質纖維化和腎小球硬化的原因，腎間質纖維化由ECM在基底膜和管周毛細血管之間沉積導致，腎小球硬化則可能是內皮細胞或足細胞代謝，機械或免疫損傷引起ECM在腎小球系膜細胞中增加所致［12］。但本研究未涉及信號通路、分子機制研究，有待于進一步研究證實。