肝癌患者組織及血清微小RNA-24和微小RNA-629的表達水平及其臨床意義▲

林 潔 黃炳臣 王 娟 黃云美 黃小英

(右江民族醫學院附屬醫院臨床病理診斷與研究中心， 廣西百色市 533000，電子郵箱：310564854@qq.com)

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，其病死率在所有腫瘤中排名前三[1-2]。有研究顯示，肝癌發生的主要危險因素是慢性HBV感染以及慢性HCV感染[3-5]，其他常見危險因素還有酗酒、糖尿病、非酒精性脂肪肝等[6]。微小RNA(microRNA,miR)是一種高度保守的單鏈非編碼小RNA，成熟的miR通過與多種蛋白質的結合形成RNA誘導的沉默復合體[7]。miR的調控具有網絡化的特性，某一miR可以靶向調節多種基因，某種基因也可能受到多種miR的調控，而目前研究發現人類60%的基因可能都受到miR的調控[8-9]。隨著對miR研究的不斷深入，越來越多的證據顯示miR在細胞的增殖、分化等重要生理過程中扮演著重要的角色[10]。為此，本研究分析肝癌患者組織及血清中miR-24、miR-629 的表達情況及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 將我院2017年2月至2018年2月收治的67例肝癌患者作為肝癌組，其中男性54例、女性13例，年齡(55.2±11.7)歲；存在血管侵犯29例；腫瘤分化程度：高分化25例，中分化23例，低分化19例。納入標準：(1)自愿參與本研究；(2)病理診斷證實為肝細胞性肝癌；(3)入院前未進行任何形式的抗腫瘤治療。排除標準：(1)入院時存在肝功能障礙的患者；(2)有其他種類的惡性腫瘤或血液病患者；(3)患者已知情此次研究，并已簽署同意書。另選取同期在我院治療的31例慢性乙型病毒性肝炎或者乙肝相關性肝硬化患者為乙肝組，其中男性25例、女性6例，年齡(55.0±10.9)歲。納入標準：(1)患者均符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》[11]中關于乙肝及肝硬化的診斷標準；(2)年齡≥30歲；(3)患者已知情此次研究，并已簽署同意書。排除標準：(1)有惡性腫瘤者；(2)有嚴重的感染性或免疫性疾病者；(3)病歷資料缺失者。選擇同期來我院進行體檢的46例健康人員為正常對照組，其中男性37例、女性9例，年齡(55.3±11.2)歲。納入標準：(1)年齡≥30歲者；(2)受試者知情此次研究，且已簽署同意書。排除標準：(1)有溝通交流障礙者；(2)已參與其他研究者。3組一般資料比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)，具有可比性。本研究獲我院醫學倫理委員會審核批準。

1.2 收集資料 收集所有研究對象的一般資料，包括年齡、性別等；收集肝癌患者血管侵犯情況以及腫瘤分化程度。

1.3 miR-24和miR-629表達水平的檢測方法

1.3.1 標本的采集及處理：(1)肝癌組和乙肝組患者在入院次日，對照組在入組當日，采集研究對象清晨空腹靜脈血5 mL置于無添加劑的真空試管中，并放在室溫下靜置30 min，使血液充分凝結。將凝結后的血液放置于低速離心機中，4℃ 2 000 r/min離心10 min后使用移液器將上清移至1.5 mL的無酶EP管中，再次4℃ 16 000 r/min離心10 min。吸取上清，用300 μL的EP管分裝，儲存于-80℃冰箱備用。(2)取肝癌患者癌組織及癌旁正常組織(距離癌組織邊緣2 cm)，用于檢測miR-629及miR-24相對表達水平。

1.3.2 特異性引物的設計及合成：根據miRBase數據庫(http://www.mirbase.org)公布的miR序列，設計特異性引物。其中，miR-24上游引物為5′-ACTAATRCCTCCCTCCTT-3′，下游為5′-ATAAACTTCTRGGTGTCC-3′；miR-629上游引物為5′-CGTGGGTTTACGTTGGG-3′，下游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′。內參U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，miR-629及U6下游引物作為通用引物，引物退火溫度保持在55℃～60℃。引物由北京天根生化科技有限公司合成。

1.3.3 檢測步驟：CFX96型PCR儀購自美國Bio-Rad公司，總RNA快速提取試劑盒(批號：rp3201)、反轉錄試劑盒(批號：rp3514)以及定量PCR試劑盒(批號：rp2027)等均購自北京的百泰克生物技術公司。按照總RNA快速提取試劑盒、反轉錄試劑盒說明書的步驟，提取血清及組織標本的總RNA，然后反轉錄為cDNA，將合成的cDNA反應液置于-20℃保存備用。PCR反應體系共25 μL，包括PCR反應液12.5 μL、cDNA模板3 μL，上下游引物各0.25 μL，超純水9 μL。PCR反應條件：94℃下30 s預變性，共1個循環；94℃下10 s變性，共39個循環；60℃下30 s退火，共39個循環。操作時均嚴格根據說明書的步驟進行檢測。通過2-ΔΔCt法計算miR的相對表達量。

1.4 統計學分析 使用SPSS 21.0軟件進行統計分析。正態分布的計量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗，非正態分布的計量資料以M(P25，P75)表示，組間比較采用秩和檢驗；計數資料以例數或百分比表示，組間比較使用χ2檢驗；采用Spearman秩相關系數進行相關性分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 肝癌患者癌組織及癌旁正常組織miR-629及miR-24的相對表達水平對比 癌組織中的miR-629、miR-24的相對表達水平分別為2.080(0.232,7.215)、1.947(0.319,10.272)，分別高于癌旁正常肝組織的1.573(0.186,4.502)、1.341(0.275,7.933)(u=4.536、3.821，P=0.001、0.003)。

2.2 3組研究對象血清miR-24和miR-629的相對表達水平比較 正常對照組、乙肝組、肝癌組的血清miR-24、miR-629相對表達水平依次升高(均P<0.05)，見表1。

表1 3組研究對象血清miR-24、miR-629相對表達水平比較[ M(P25，P75)]

2.3 肝癌患者血清miR-629、miR-24的相對表達水平與臨床病理指標的相關性 血清miR-629、miR-24的相對表達水平與血管侵犯情況以及腫瘤分化程度呈正相關(均P<0.05)，見表2。

表2 肝癌患者血清miR-629、miR-24的相對表達水平與臨床病理指標的相關性

3 討 論

MiR-24是近年被發現的參與基因表達調控且廣泛存在于人類組織細胞的微小RNA分子，共有兩個亞簇，即miR-24-1和miR-24-2，其編碼基因分別定位于人類9q22和19p13,兩個亞簇具有相似的生物學活性[12-13]。而miR-629定位于15q23。研究表明，miR-24和miR-629可與相應靶基因mRNA 3′非翻譯區互補結合，從而在細胞的生長與分化過程中發揮重要的調控作用，它們的表達失調與各類腫瘤的發生密切相關[14]。本研究結果顯示，癌組織中的miR-629及miR-24的相對表達水平均高于正常肝組織，肝癌患者血清中miR-629及miR-24的相對表達水平均高于正常對照組(均P<0.05)，即miR-629及miR-24在肝癌組織及外周血中均表達上調，表明兩者在肝癌的形成過程中發揮了一定的作用。進一步行相關性分析發現，血清miR-629、miR-24的相對表達水平均與血管侵犯情況以及腫瘤分化程度呈正相關(均P<0.05)，因此血清miR-629及miR-24水平的檢測可能有助于評估肝癌患者的病情[15-16]。

目前認為慢性肝炎→肝硬化→非典型增生→肝癌是肝組織腫瘤化過程中的重要病理變化，但由慢性肝炎到肝癌惡性轉化過程(即腫瘤化)中關鍵的分子事件并未完全清楚[17]。前期研究表明，DNA 損傷修復功能缺陷在慢性肝炎的惡性轉化過程中可能起重要作用，而 miR-24/miR-629 在消化系統癌組織中出現異常表達[18-19]。MiR-629、miR-24這兩種miR的高表達受核因子激活的B細胞的κ-輕鏈調控，且這種異常在具有慢性肝炎背景的組織中更為明顯，這提示 DNA 損傷及 miR-24/miR-629 間可能存在一種網絡關系，并可能在慢性肝炎的惡性轉化過程中起重要作用[20]。因此，深入研究 DNA 損傷/miR-24/miR-629 在慢性肝炎的惡性轉化過程中的作用具有重要科學價值，其有助于闡明慢性肝炎由可控到不可控、再到惡性轉化過程中的關鍵分子事件，并對進一步認識肝癌的發生機制、加強肝癌的防治具有重要意義[21]。本研究結果顯示，正常對照組、乙肝組、肝癌組的血清miR-24、miR-629的相對表達水平依次升高(均P<0.05)，表明隨著肝臟病變嚴重程度的增加，血清中的miR-629及miR-24的水平也逐漸升高，這提示miR-24、miR-629在慢性肝炎的惡性轉化過程中起重要作用。

綜上所述，肝癌患者癌組織及血清中的miR-629、miR-24的表達水平均上調，其可能在肝癌的發生以及慢性肝炎的惡性轉化過程中起到重要作用，而血清miR-24和miR-629的檢測或有助于評估肝癌患者的病情。