無創胚胎染色體篩查技術對單囊胚凍胚復蘇移植臨床結局的影響▲

肖 露 權 利 梁紅星 廖美霞 范曉波 陳西平 李寶香 涂 劍

(湖南省岳陽市婦幼保健院生殖醫學中心，岳陽市 414000，電子郵箱：xl2012cy@163.com)

染色體篩查是輔助生殖技術(assisted reproductive technology,ART)的重要組成部分。胚胎植入前遺傳學篩查(preimplantation genetic screening,PGS)是胚胎染色體篩查的重要技術手段，它能提高臨床妊娠率，降低早期流產率，并減少畸形兒的出生[1]。但PGS是一種有創的染色體篩查技術，可能會對胚胎后續發育造成潛在的、尚未知曉的影響。無創胚胎染色體篩查技術(noninvasive chromosome screening,NICS)通過檢測胚胎培養液及囊腔液樣本分析胚胎染色體的拷貝數，其結果與胚胎樣本染色體拷貝數高度相關，敏感性和特異性均高達80%以上[2]。但目前未見有關NICS檢測提示染色體正常的囊胚移植的臨床結局的研究報道。本研究比較NICS檢測提示為染色體正常的囊胚移植與Gardner囊胚評分[3]法評估為形態學質量為優的囊胚移植之間的臨床結局，探討NICS檢測對單囊胚移植臨床結局的影響，旨在為ART周期中運用NICS檢測染色體提供臨床依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性分析2016年11月至2019年9月在我院生殖醫學中心行體外受精-胚胎移植(invitrofertilization-embryo transfer,IVF-ET)的372例不孕夫婦(372個移植周期)的臨床資料。納入標準：(1)女方年齡35～40歲；(2)ART周期中獲卵≥15個或者人絨毛促性腺激素注射當日血清雌二醇水平≥5 000 pg/mL；(3)18 kg/m2≤女方體質指數≤28 kg/m2；(4)同意選擇單囊胚凍胚復蘇移植；(5)根據Gardner囊胚評分法評估形態學質量，符合移植條件的囊胚數≥2個；(6)無內科并發癥；(7)符合國家計劃生育政策。排除標準：(1)夫妻任一方有ART治療禁忌證；(2)女方既往自發性流產>3次；(3)女方單側卵巢切除；(4)有如下明確原因的不孕患者，如單側或雙側輸卵管積液、瘢痕子宮、子宮畸形、子宮內膜異位癥、子宮腺肌癥、子宮內膜息肉、宮腔粘連或其他影響子宮內膜環境的病變；(5)女方患有不宜生育的嚴重遺傳性疾病、嚴重軀體疾病、精神心理障礙等。在移植前所有囊胚形態學質量經Gardner囊胚評分[3]評估都符合移植要求。將其中愿意接受NICS檢測并且檢測結果顯示囊胚染色體拷貝數正常的75例，設為染色體拷貝數正常囊胚移植組(A組)；愿意接受NICS檢測并且檢測結果顯示囊胚染色體拷貝數異常的73個優質囊胚將不用于臨床移植，不納入任何一組；其余224例設為形態學優質囊胚移植組(B組)。兩組的女方年齡、不孕年限、體質指數和移植日子宮內膜厚度比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)，見表1。本研究已通過岳陽市婦幼保健院醫學倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

表1 兩組間基本資料的比較(x±s)

1.2 IVF-ET及NICS檢測 所有女方均接受本中心常規采用的促性腺激素釋放激素激動劑降調節進行超排卵：采用早卵泡期長效長促排卵方案，月經第1～4天行陰道B超和血促卵泡激素、黃體生成素、雌二醇、孕酮檢查，予以注射長效達菲林(生產廠家：Ipsen Pharma Biotech；規格：3.75 mg/支)3.75 mg，28～30 d后復查陰道B超和血促卵泡激素、促黃體生成素、雌二醇、孕酮值。若達到降調標準(降調標準：卵泡直徑≤5～8 mm、子宮內膜≤5 mm、雌二醇<50 pg/mL、促卵泡激素及促黃體生成素<5 mIU/mL、孕酮<0.9 ng/mL)，予以注射Gn(果納芬，生產廠家：MerckSeronoS.p.A；規格：300 IU/0.5 mL)啟動。至扳機時機(扳機時機：主導卵泡群直徑≥17 mm與≥14 mm卵泡數的比值達60%～70%)，予注射艾澤(規格：250 μg:0.5 mL)扳機。扳機后36 h采卵，行體外受精。兩組均行體外受精，將受精卵置于培養箱內采用G-1TM培養液(瑞典Vitrolife公司,型號：10128)行單微滴單胚胎培養72 h后，換G-2TM(瑞典Vitrolife公司,型號：10132)囊胚培養液繼續培養。培養液為Vitrolife公司G5系列培養液，培養箱為美國COOK公司K-MINC-1000型培養箱。

培養至120 h(D5)～144 h(D6)，行形態學評估后，對接受NICS檢測的患者囊胚進行激光皺縮，5～10 min后取30 μL囊胚培養液，送億康基因有限公司進行NICS檢測(多次退火環狀循環擴增技術單細胞全基因組擴增+高通量測序)，篩選染色體正常胚胎進行移植；不接受NICS檢測的形態學優質囊胚直接進行移植[3-4]。

1.3 觀察指標 觀察兩組患者的臨床結局，包括臨床妊娠率、早期流產率、持續妊娠率、異位妊娠率、活產率、新生兒畸形率。判斷標準：移植后4周行B超檢查，宮腔內見妊娠囊確定為臨床妊娠；發生在孕12周以前的流產定義為早期流產；持續妊娠是指懷孕持續到20周或以后；發生在子宮底或子宮體之外的妊娠定義為異位妊娠，異位妊娠亦記為臨床妊娠；胎兒分娩后，存在呼吸或其他生命征象(如心臟跳動等)均被定義為活產嬰兒；胎兒出生前已經存在的結構或功能異常為新生兒畸形。臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/移植總周期數×100%；早期流產率=早期流產周期數/臨床妊娠周期數×100%；持續妊娠率=持續妊娠周期數/臨床妊娠周期數×100%；異位妊娠率=異位妊娠周期數/臨床妊娠周期數×100%；活產率=有活產周期數/移植總周期數×100%；新生兒畸形率=畸形嬰兒數/活產嬰兒數×100%。

1.4 統計學分析 采用SPSS 23.0和GraphPad Prism 7進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用兩樣本獨立t檢驗；計數資料以例數或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 NICS檢測情況 對148枚Gardner囊胚評分法形態學質量為優的囊胚(見圖1)進行NICS檢測，結果提示75枚Gardner囊胚評分法形態學質量為優的囊胚的染色體拷貝數正常，其余73枚Gardner囊胚評分法形態學質量為優的囊胚的染色體拷貝數異常(見圖2)，包括39枚為非整倍體，22枚為嵌合體，12枚為染色體檢測結果不明確。將NICS檢測染色體拷貝數正常的Gardner囊胚評分法形態學質量為優的囊胚進行移植，而染色體拷貝數異常的Gardner囊胚評分法形態學質量為優的囊胚終止ART周期。

圖1 D5～D6 Gardner囊胚評分法形態學質量為優的囊胚

圖2 NICS檢測形態學優質囊胚的染色體拷貝數結果

2.2 兩組臨床結局比較 A組的新生兒畸形率低于B組，活產率高于B組(均P<0.05)；但兩組之間的臨床妊娠率、早期流產率、持續妊娠率和異位妊娠率差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表2。

表2 兩組臨床結局比較

3 討 論

隨著二孩政策的全面放開，許多高齡女性渴望再生育，但隨著年齡的增長，女性生殖能力逐漸下降，尤其35歲以后下降更為明顯。這促使有生育要求的高齡孕婦選擇通過ART來實現生育。研究表明，ART受孕與自然受孕的新生兒出生缺陷發生率差異無統計學意義[5-8]。但通過ART方式獲得的胚胎，仍有40%～60%存在染色體異常，且隨孕婦年齡增大，染色體異常的風險呈上升趨勢[9]。而胚胎染色體異常時導致ART失敗的主要原因[10]。ART周期中PGS是胚胎染色體篩查的重要技術手段，采用PGS進行胚胎染色體篩查，可降低試管嬰兒流產率，提高臨床妊娠率[11-12]。但PGS的標本采集方式對胚胎存在一定的創傷。研究表明，有創性的活檢有可能會引起胚胎發育節點時間延長，并造成表觀遺傳修飾異常[13-14]和胎盤異常[15-16]等不利影響。

本研究中，A組的新生兒畸形率低于B組，而活產率高于B組(P<0.05)；但兩組之間的臨床妊娠率、持續妊娠率、早期流產率、異位妊娠率差異無統計學意義(P>0.05)。本研究對Gardner囊胚評分法形態學質量為優的囊胚進行NICS檢測，發現這些囊胚部分亦存在染色體拷貝數異常，這種異常可能導致某些基因(如MPP1)的缺失、減少或增多[17]，從而導致活產率降低和新生兒畸形率升高[18]。

綜上所述，與單純傳統胚胎形態學評分比較，聯合NICS能夠提高單囊胚凍胚復蘇移植的活產率，降低新生兒畸形率。這為臨床ART周期中染色體篩查提供新的思路，而合理應用NICS能更好地實現ART技術中優生優育的目的。但由于本研究為單中心回顧性研究，同時周期數量有限，所得結果可能存在一定的偏差，今后還需進一步進行多中心、多周期的前瞻性或回顧性研究以驗證。