香芹酚-酪蛋白納米顆粒制備及其對(duì)枇杷果實(shí)炭疽病的抑制作用

花春陽,李卓燁,金 鵬,覃定奎,杜琪珍

（浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州 311300）

病原微生物引起的腐爛是造成果蔬采后損失的主要原因,由此帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1],因此,研發(fā)用于果蔬保鮮的安全防腐劑至關(guān)重要[2]。近年來,納米技術(shù)在采后果蔬保鮮方面受到關(guān)注[3]。其研究主要集中在以下兩方面：一方面,在果蔬包裝材料中使用金屬氧化物類納米顆粒（nanoparticles,NPs）（如納米TiO2、納米ZnO、納米CuO等）可以間接避免果蔬在貯運(yùn)過程中受到病菌污染；另一方面,在果蔬表面噴涂納米化的抗菌劑（如納米化肉桂醛、納米化葡聚糖）可以直接預(yù)防果蔬的腐敗[4]。

香芹酚（carvacrol,CL）是一種酚類單萜類化合物[5],廣泛存在于牛至、百里香、胡椒、佛手柑等植物的精油中。在植物來源的酚類化合物中,由于CL存在游離羥基和酚基,其抗菌活性高于其他揮發(fā)性化合物[6]。然而,CL因具有揮發(fā)性、疏水性而容易被氧化和熱降解,導(dǎo)致應(yīng)用時(shí)分散不均、時(shí)效短和穩(wěn)定性差。此外,CL的疏水性也使其在食物保鮮過程中易與脂質(zhì)和蛋白質(zhì)結(jié)合,從而降低抗菌效果[7]。因此,納米和微乳液包埋（如納米醇質(zhì)體、纖維素衍生物[8]或生物聚合物制備的微球、殼聚糖[9]和交聯(lián)的明膠[10]制備的納米復(fù)合物）成為解決上述問題的重要策略。

酪蛋白（casein,CS）是牛乳中主要的乳蛋白（占牛乳蛋白的80%）,在食品和飲料行業(yè)中是一種低成本的食品級(jí)添加劑[11]。天然酪蛋白在溶液中可以自組裝成納米微團(tuán)結(jié)構(gòu),其直徑大約為80～400 nm,已被廣泛用作疏水試劑輸送系統(tǒng)的有效納米載體[12-13]。本實(shí)驗(yàn)通過低能量、簡(jiǎn)單的自乳化技術(shù),利用低成本的食品級(jí)酪蛋白制備香芹酚-酪蛋白納米顆粒（CL-CS-NPs）,對(duì)其物理性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定,并對(duì)其在枇杷果實(shí)上的抗菌效果進(jìn)行分析,以期為CL-CS-NPs的生產(chǎn)及其采后預(yù)防果實(shí)腐爛提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

100 kg成熟‘白沙’枇杷（Eriobotrya japonica(Thunb.) Lindl.cv.Baisha）,采自浙江省杭州市余杭區(qū)琵琶灣枇杷園,3 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,挑選顏色較一致、表面無缺陷的果實(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

酪蛋白（純度大于98%） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；CL（純度99%） 上海源葉生物科技有限公司；乙醇、磷酸、乙醚均為國(guó)產(chǎn)分析純；甲醇為國(guó)產(chǎn)色譜純。

LB培養(yǎng)基（含10 g/L色氨酸、5 g/L酵母提取物、10 g/L氯化鈉和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%葡萄糖）。

1.2 儀器與設(shè)備

Zetasizer Nano ZS90型納米粒徑電位分析儀 英國(guó)馬爾文儀器有限公司；TGL-16G型高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；KQ5200B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；XW-80A漩渦混合儀 上海馳唐電子有限公司；ZNCL-GS磁力攪拌器 杭州明遠(yuǎn)儀器有限公司；JY92-IIN超聲儀 上海滬析儀器有限公司；ME104E/02電子天平 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；高效液相色譜系統(tǒng) 日本Shimadzu公司；H-9500E透射電子顯微鏡日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 游離CL、酪蛋白+CL混合物和CL-CS-NPs的制備

游離CL：將CL溶于乙醚配制成一定的質(zhì)量濃度,即得到游離CL。

酪蛋白+CL混合物：將游離CL添加于酪蛋白溶液（2 mL）,漩渦混勻3 min即得到酪蛋白+CL混合物。

CL-CS-NPs：將酪蛋白完全溶解于去離子水中,配制成終質(zhì)量濃度20 mg/mL溶液。CL溶于無水乙醇中,配制成終質(zhì)量濃度300 mg/mL溶液。將10 mL酪蛋白溶液置于50 mL玻璃燒杯中,在磁力攪拌器上攪拌（500 r/min）,同時(shí)將CL溶液以10 μL的體積分多次加入到酪蛋白溶液中（至CL質(zhì)量濃度分別為3、6、9、12、15 mg/mL）,然后超聲處理5 min（22 Hz、50 W）,即得到CL-CS-NPs分散液。將CL-CS-NPs置于冷藏室（4～10 ℃）貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 CL-CS-NPs分散液中CL包埋率測(cè)定

取1.3.1節(jié)制備的不同CL質(zhì)量濃度CL-CS-NPs分散液（5 mL）,3 000×g離心10 min,使游離的CL（不溶于水）與納米分散液分層,在納米分散液層取50 μL,加450 μL甲醇沉淀蛋白并提取CL,甲醇提取液用高效液相色譜外標(biāo)法測(cè)定待測(cè)液CL質(zhì)量濃度。高效液相色譜測(cè)定條件為： C18柱（250 mm×4.6 mm,5 μm）；流動(dòng)相為甲醇/水/磷酸（30∶70∶0.01,V/V）,流速為1 mL/min,柱溫為30 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。離心后納米分散液中的CL質(zhì)量即為CL-CS-NPs包埋的CL質(zhì)量。包埋率按式（1）計(jì)算。

1.3.3 CL-CS-NPs物理性質(zhì)的測(cè)定

將500 μL CL-CS-NPs顆粒分散液用去離子水稀釋成5 mL,用Zetasizer Nano ZS90型納米粒徑電位分析儀測(cè)定CL-CS-NPs的粒徑分布、多分散指數(shù)（polydispersity index,PDI）和Zeta電位。測(cè)定溫度25 ℃、激光波長(zhǎng)633 nm。

1.3.4 CL-CS-NPs納米粒微觀結(jié)構(gòu)觀察

首先用純水稀釋的CL-CS-NPs分散液,然后將其吸附到附著在金屬樣品網(wǎng)格的碳涂層膜上。接著用吸水紙去除多余樣品,并用一滴染色液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%磷鎢酸）覆蓋網(wǎng)格。染色數(shù)分鐘后去除多余的溶液。待樣品徹底風(fēng)干,然后用H-9500E透射電子顯微鏡對(duì)CL-CS-NPs進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)觀察。

1.3.5 CL-CS-NPs釋放性分析

將CL-CS-NPs分散液（CL 10 μg/mL）或酪蛋白+CL混合物（CL 10 μg/mL）分別噴灑在固體LB培養(yǎng)基（固化前體積為5 mL）表面（10 μL/cm2）,然后置于28 ℃培養(yǎng)箱中,每隔24 h取出一批培養(yǎng)皿,將培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基取出,置于三角瓶中,用20 mL乙醚提取CL（提取3 次）,合并提取液,氮吹揮發(fā)乙醚,用適量甲醇溶解提取物,通過高效液相色譜測(cè)定甲醇溶液中CL質(zhì)量濃度,并計(jì)算培養(yǎng)基中CL存留量。游離CL用乙醚溶解并噴灑在固體培養(yǎng)基表面（10 μL/cm2）,待乙醚揮發(fā)后置于28 ℃培養(yǎng)箱中,CL存留量分析同處理組。

1.3.6 病菌培養(yǎng)

參照本課題組前期的實(shí)驗(yàn)方法[14],從腐爛枇杷果實(shí)中分離出炭疽菌（Colletotrichum acutatum）。然后將菌絲體在28 ℃的LB瓊脂培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)5 d作為種子。

1.3.7 CL-CS-NPs離體抗菌活性分析

CL-CS-NPs、酪蛋白+CL混合物抑菌活性測(cè)定：在培養(yǎng)基表面分別噴灑CL-CS-NPs分散液10 μL/cm2（CL 10 μg/mL）、酪蛋白+CL混合物10 μL/cm2（CL 10 μg/mL）和1.3.5節(jié)CL-乙醚,之后在培養(yǎng)基中央接種5 μL孢子懸浮液,然后在28 ℃下培養(yǎng)。在沒有CL的情況下進(jìn)行相同的對(duì)照實(shí)驗(yàn)。每隔24 h測(cè)定菌斑的直徑,計(jì)算菌斑增長(zhǎng)率（式（2））。病斑增長(zhǎng)率實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.8 CL-CS-NPs對(duì)枇杷炭疽病的抗菌活性分析

用無菌生理鹽水擦洗枇杷果實(shí)表皮,用無菌注射針在每果中部接種5 μL炭疽菌孢子懸液（1×105孢子/mL）。將含等量CL（10 μg/mL）的酪蛋白+CL混合物樣品溶液和CL-CS-NPs分散液噴在果實(shí)表面。每組10 個(gè)枇杷果實(shí),重復(fù)3 次。對(duì)照組用無菌蒸餾水處理。隨后,所有處理過的樣品在28 ℃的無菌室中儲(chǔ)存。測(cè)定并記錄疾病發(fā)生率和病變直徑。將接種孔處出現(xiàn)腐爛斑點(diǎn)和果肉顏色變化的枇杷定義為發(fā)病枇杷。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì),用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件采用單因素方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用Duncan法進(jìn)行多重比較,P＜0.05認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 CL-CS-NPs的制備、表征與相對(duì)抑菌活性

表1 不同CL質(zhì)量濃度制備的CL-CS-NPs的特性及包埋率Table 1 Characterization and encapsulation rate of CL-CS-NPs prepared at different CL concentrations

如表1所示,CL-CS-NPs的粒徑、分散性（PDI）、Zeta電位和包埋率與制備時(shí)添加的CL質(zhì)量濃度有關(guān)。CL質(zhì)量濃度從3 mg/mL增加到12 mg/mL,CL-CS-NPs的粒徑僅從121.9 nm增加到152.6 nm；但CL質(zhì)量濃度增加到15 mg/mL時(shí),納米顆粒粒徑則增加到370.7 nm,表明過量CL誘發(fā)了納米顆粒的聚集。納米顆粒的聚集導(dǎo)致分散液的透光率顯著降低（圖1A）。CL-CS-NPs的Zeta電位絕對(duì)值與CL的粒徑呈負(fù)相關(guān),表明CL導(dǎo)致納米顆粒所帶負(fù)電荷的減少。Zeta電位與納米顆粒的穩(wěn)定性有一定的相關(guān)性,通常對(duì)粒徑相同的粒子,所帶電荷越多,相互之間的斥力越大,分散液體系的穩(wěn)定性越高。本研究中只有CL質(zhì)量濃度增加到15 mg/mL才導(dǎo)致Zeta電位發(fā)生顯著改變,因此,可以認(rèn)為CL質(zhì)量濃度3～12 mg/mL制備的納米顆粒穩(wěn)定性與所帶電荷的關(guān)系不大。CL質(zhì)量濃度在3～12 mg/mL,納米顆粒的包埋率變化不顯著,但CL質(zhì)量濃度增加到15 mg/mL時(shí),包埋率降低,且與其他質(zhì)量濃度之間有顯著性差異（P＜0.05）。

不同CL質(zhì)量濃度制備的納米分散液在相同CL添加量時(shí)對(duì)炭疽菌的抑制活性如圖1B所示,結(jié)果表明,15 mg/mL CL制備的納米顆粒抑菌活性較其他質(zhì)量濃度CL制備的納米分散液顯著降低（P＜0.05）。從表1中可以看出,15 mg/mL CL制備的納米顆粒的粒徑比其他幾種質(zhì)量濃度制備的粒徑大1 倍以上,提示粒徑對(duì)抑菌活性有較大的影響。大的藥物裝載量在制備和使用時(shí)更經(jīng)濟(jì),因此,從藥物裝載量和抑菌活性兩方面綜合考慮,采用12 mg/mL CL是較理想的,透射電子顯微鏡觀察表明,該納米分散液中的納米顆粒呈球形,均勻性較好（圖1C）。

圖1 CL-CS-NPs納米分散液（A）及其相對(duì)抑菌活性（B）和CL 12 mg/mL制備的樣品透射電子顯微鏡圖（C）Fig.1 Samples of CL-CS-NPs nanodispersions (A) and their relative anti-fungal activity (B), and transmission electron microscope of CL-CS-NPs nanodispersion prepared with 12 mg/mL CL (C)

2.2 CL-CS-NPs的CL釋放性

為了研究CL-CS-NPs的CL緩釋效果,測(cè)定了28 ℃下不同時(shí)間LB固體培養(yǎng)基上CL存留量。如圖2所示,游離CL處理、酪蛋白+CL混合物處理、CL-CS-NPs處理CL接近揮發(fā)完全的時(shí)間分別為2、4 d和6 d,CL-CS-NPs處理組的緩釋時(shí)間較游離CL處理組和酪蛋白+CL混合物處理組分別延長(zhǎng)了4 d和2 d。表明納米化CL緩釋效果明顯,應(yīng)用CL-CS-NPs可以延長(zhǎng)CL對(duì)病菌的作用時(shí)間。

圖2 培養(yǎng)基上噴灑CL-CS-NPs、酪蛋白CL混合物和游離CL不同時(shí)間的CL存留率Fig.2 Retention rates of CL after incubation of CL-CS-NPs, casein +CL mixture and free CL on the culture medium for different periods

2.3 CL-CS-NPs對(duì)離體枇杷炭疽菌的抑制作用

圖3 培養(yǎng)基上噴灑CL-CS-NPs和其他處理抑菌效果比較Fig.3 Comparison of in vitro antifungal effects of CL-CS-NPs,CL + CS mixture and free CL

如圖3所示,CL-CS-NPs組的完全抑菌時(shí)間達(dá)到5 d,酪蛋白+CL混合物和游離CL組均為3 d。由于游離CL組CL揮發(fā)快,因此在3 d之后,菌斑增長(zhǎng)率開始迅速升高,而酪蛋白+CL混合物中的CL由于酪蛋白的作用可相對(duì)延緩CL揮發(fā)時(shí)間。CL-CS-NPs中的CL能夠緩釋,使得病菌被CL作用的時(shí)間大幅延長(zhǎng),因而完全抑制病菌生長(zhǎng)的時(shí)間也大幅延長(zhǎng)。因此,將CL-CS-NPs分散液直接噴涂在枇杷果實(shí)上,可較好地抑制枇杷腐爛。

2.4 CL-CS-NPs在枇杷果實(shí)上的防腐作用

由圖4可知,接種5 d后,噴涂蒸餾水的枇杷果實(shí)（空白對(duì)照）腐爛已比較嚴(yán)重,而噴涂CL-CS-NPs分散液的枇杷果實(shí)基本沒有出現(xiàn)腐爛（圖4A）。接種7 d后CL-CS-NPs組的平均病斑直徑僅為1.5 mm（圖4B）,發(fā)病率僅為10%（圖4C）,表明大多數(shù)枇杷果實(shí)沒有被病菌侵害,抗菌劑的效果良好。相對(duì)而言,噴涂酪蛋白+CL混合物的枇杷果實(shí)5 d后病斑直徑也相對(duì)較小,但發(fā)病率高達(dá)80%；7 d后的病斑平均直徑達(dá)到4.8 mm,腐爛比較嚴(yán)重。由此可見,CL-CS-NPs在枇杷果實(shí)上的抗菌效果良好,能夠用于采后枇杷果實(shí)及其他一些水果的抑菌防腐。

圖4 CL-CS-NPs分散液抑制枇杷炭疽菌引起的枇杷腐爛作用Fig.4 CL-CS-NPs dispersion inhibited anthracnose rot in loquats

3 討 論

酪蛋白納米載體由于其優(yōu)良的乳化性[15]和可自組裝膠束的性質(zhì)[16],被廣泛用作疏水藥物和生物活性化合物的遞送系統(tǒng)[17-20]。本研究表明,CL可以與酪蛋白的低極性氨基酸殘基（如酪氨酸殘基）相互作用,從而使酪蛋白+CL混合物釋放CL的速率顯著放緩；而CL被制備成CL-CS-NPs后,其釋放CL的速率又能進(jìn)一步大幅減緩。培養(yǎng)基上噴灑游離CL、酪蛋白+CL混合物、CL-CS-NPs得到的CL釋放速率結(jié)果與枇杷果實(shí)上接種炭疽菌后涂布游離CL、酪蛋白+CL混合物、CL-CS-NPs產(chǎn)生的抑菌效果（圖3、4）基本一致。由此可以得出,CL-CS-NPs噴涂比其他處理抑制效果增強(qiáng)的主要原因是納米顆粒的緩釋作用使得功效成分抗菌作用的時(shí)效大大延長(zhǎng)。

枇杷是我國(guó)南方特有的水果,以口感好、營(yíng)養(yǎng)豐富而著稱。枇杷通常在溫暖的雨季成熟,易發(fā)生微生物感染,每年遭受的經(jīng)濟(jì)損失巨大。炭疽真菌引起的炭疽病是枇杷果實(shí)采后的主要病害[21-23]。雖然冷藏是一種被廣泛應(yīng)用的防腐技術(shù),可以保持枇杷特有的風(fēng)味,但冷藏會(huì)引起果肉的堅(jiān)韌性和木質(zhì)化,使枇杷果實(shí)品質(zhì)顯著下降[24]。傳統(tǒng)上,枇杷果實(shí)采后病害的防治主要采用殺菌劑（如苯醚甲環(huán)唑、異菌脲、啼菌環(huán)胺、多菌靈、甲基硫菌靈、施保工等[25]）,由于殺菌劑殘留物對(duì)環(huán)境和人類健康的負(fù)面影響,近年來,采取其他措施控制枇杷果實(shí)的采后病害受到重視[26]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者選擇安全無毒的物質(zhì)替代化學(xué)殺菌劑的研究越來越多[27]。Cao Shifeng等[28-29]使用茉莉酸甲酯處理接種炭疽菌的枇杷果實(shí),發(fā)現(xiàn)該處理能降低枇杷果實(shí)的發(fā)病率、病斑直徑以及提高枇杷果實(shí)的貯藏品質(zhì)。張春萍等[30]使用殼聚糖和那他霉素涂膜液處理枇杷果實(shí),發(fā)現(xiàn)該處理能夠減少枇杷果實(shí)的腐爛。Schirra[31]和Liu Fengjuan[32]等對(duì)枇杷果實(shí)用加熱和皮氏畢赤酵母聯(lián)合處理,結(jié)果表明,該方法對(duì)炭疽病有一定的防治效果。Wang Kaituo等[33]用乙醇處理枇杷果實(shí)后,發(fā)現(xiàn)枇杷炭疽病得到明顯抑制。以上方法各有優(yōu)缺點(diǎn),可為解決枇杷腐爛問題提供技術(shù)支撐。

本研究采用食品安全性高的酪蛋白包埋天然抗菌物質(zhì)CL,由于納米顆粒的緩釋作用使得CL發(fā)揮抗菌作用的時(shí)間大幅延長(zhǎng),所得納米化的CL對(duì)枇杷的抗炭疽菌效果顯著提高。這種納米化的CL有望在枇杷的產(chǎn)后保鮮中得到實(shí)際應(yīng)用。進(jìn)一步的研究有望將CL-CS-NPs分散液開發(fā)成果蔬抗菌保鮮劑。