石墨烯對人牙槽骨骨髓間充質干細胞增殖分化的影響

王 熙 ，張淑悅 ，黃呈森，王美艷 ，周宏偉 ，李 健

（1.承德護理職業學院，河北 承德 067000；2.唐山市人民醫院，河北 唐山 063000；3.廈門大學附屬翔安醫院，福建 廈門 361000）

牙槽骨缺損一直都是口腔臨床醫學研究的熱點問題。目前自體骨移植依然是解決這一問題的主要方式，然而諸如二次創傷給病人帶來的心理生理痛苦、并發癥的出現、自體骨供給量的局限性等弊端也日益明顯[1]。隨著組織工程學的飛速發展，利用誘導成骨轉錄因子、調控miRNA結合支架材料來促進成骨，是重建缺損牙槽骨的理想修復方法。牙槽骨骨髓間充質干細胞（AB－BMSCs）是目前最新發現的成體干細胞類型，來源于上下頜的牙槽骨中，其具有取材方便、量大、無二次創傷等優點[2]。作為優良的種子細胞，運用組織工程技術將牙槽骨骨髓間充質干細胞應用于頜面部骨缺損修復，將成為骨修復的新方法。在組織工程領域，支架材料是必不可少的要素之一。支架材料中石墨烯是人工合成的一種二維納米晶體，人們常見的石墨烯是由一層層以蜂窩狀有序排列的平面碳原子堆疊而形成的；三維結構的石墨烯由碳納米管支柱支撐平面碳原子，這可以產生獨特的強度、韌性和延展性的混合結構。在生物醫學領域，石墨烯的納米載藥、生物檢驗及腫瘤的光熱療法逐步應用于臨床；在組織工程領域，國外學者Nayak、Lee等[3－4]均通過在石墨烯膜上接種附著不同材質的骨髓間充質干細胞證實附著介質不同，細胞增殖分化效果也不一致。本文通過AB－BMSCs的分離培養與鑒定、CCK－8檢測、Real－Time PCR 等實驗研究石墨烯對 ABBMSCs增殖及成骨分化的影響，探索石墨烯在骨重建中的應用。

1 材料與方法

1.1 細胞來源

排除疾病、激素等其他全身因素及局部因素對于細胞生長的干擾，經唐山市人民醫院倫理委員會審批，具體納入情況如下：在45名自愿捐獻牙槽骨骨屑者中，排除了具有全身疾病因素的17名病人，包括合并高血壓（3名）、糖尿病（5名）、其他系統性疾病（9名）；局部因素的8名病人，包括齲齒（2名）和智齒冠周炎（6名）。實驗入選者為自愿捐贈牙槽骨骨屑的20位男性病人，年齡在 17～30 歲之間，平均年齡（23．5±5．24）歲，拔除牙齒原因包括正畸要求拔牙（6名）、下頜阻生齒拔除（7名）及種植病人（7名）。

1.2 主要試劑和儀器

α－MEM細胞培養基、FBS溶液（美國Gibco公司），PBS緩沖液（美國 Hyclone公司），6、24、96孔培養板（比利時 Orange Scientific公司），4%多聚甲醛溶液（北京鼎國生物技術有限責任公司），TritonX－100（上海索萊寶科技有限公司），Rb Anti－CD34、Rb Anti－CD44、Rb Anti－CD90（天津賽爾生物技術有限公司），DAPI溶液（北京索萊寶科技有限公司），石墨烯（北京航空航天大學實驗室），dNTP溶液（10 mmol/L）、RNasin溶液、M－MLV 逆轉錄酶、SYBR Premix Ex Taq試劑盒（日本Takara公司），Ethidium Bromide（EB）（北京鼎國生物技術有限責任公司），正常熔點瓊脂糖凝膠、低熔點的瓊脂糖凝膠（美國GIBCO公司），CCK－8檢測試劑盒（東仁化學科技上海有限公司），BMP2、RUNX2、COL－1（蘇州吉瑪生物科技有限公司），iQ5 Real－Time PCR擴增儀（美國Applied Biosystems公司），5415D型離心機（德國Eppendorf公司），CO2恒溫培養箱（美國Thermo Forma公司），超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司），倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司），熒光顯微鏡（日本SONY公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 原代人牙槽骨骨髓間充質干細胞的分離、培養與鑒定常規消毒、拔牙后，咬骨鉗或刮匙刮取骨屑，或種植逐級備洞時器械上存留的骨屑，將骨屑置入含1%雙抗的PBS液中，對骨屑進行反復吹打沖洗，3次洗滌后放到離心機內離心2次，每次5 min，棄上清液，沉淀骨屑移到小培養皿內（直徑6 cm），置于恒溫37℃、體積5%CO2培養箱之中15 min，將骨屑貼于小皿內壁，輕輕加20%α－MEM培養基2 ml，放入培養箱進行細胞培養，期間間隔5天換1次液，當細胞生長達到底面積的80%左右時，觀察細胞生長狀況及形態變化。選用干細胞表面表達標記物CD34、CD44、CD90對培養的原代細胞進行免疫熒光鑒定。將實驗中經過分離、培養、鑒定的原代BMSCs作為種子細胞，用含0．02%EDTA的0．25%胰蛋白酶消化，傳代培養。取第四代細胞用于實驗研究。

1.3.2 氧化石墨烯水溶膠培養皿制備 用去離子水把氧化石墨烯粉溶解之后，利用超聲波清洗器對溶液進行清洗處理，待氧化石墨的片層被剝離形成淡黃色生成物（氧化石墨懸浮液）后，將懸浮液放置到離心機內，離心10 min（13 000 rpm）后分為兩層，上層清液為氧化石墨烯懸浮液（留取），下層沉淀物是無法剝離的氧化石墨（去除），獲取的氧化石墨烯懸浮液因為含有豐富的含氧功能團，在功能團輔助下，不同的氧化石墨片層之間產生了靜電排斥效果，使氧化石墨烯層被良好分散出來。將石墨烯材料剪成與不同規格玻璃片同等大小，超純水清洗3次，75%醫用酒精中浸泡清洗5 min，紫外滅菌后按規格不同分別放入6孔板及24孔板中。

1.3.3 實驗分組 取第四代細胞，將其分為3組，即空白組（細胞培養的接種材料為普通塑料性細胞培養皿）、對照組（所用接種材料為塑料培養皿+玻璃片）、實驗組（所用接種材料是塑料培養皿+石墨烯水溶膠）。

1.3.4 CCK-8檢測細胞增殖活性 取第四代細胞進行分組，以密度為5×104個/孔將各組細胞分別加入24孔板中，每組均同時設兩個細胞復孔。37℃、5%CO2培養箱體外分別培養1天、2天、3天、4天，棄去舊培養基，每孔更換新培養基300 μL和CCK－8試劑30 μL。將24孔板再次移到培養箱中培養2 h終止反應，將各孔內溶液混勻后分別移到96孔板（100 μL/孔）中待檢測，檢測前輕輕晃動96孔板，混勻孔內的培養基，用酶標儀檢測450 nm波長條件下各孔的吸光值，并記錄結果，實驗取3個樣本，重復3次。

1.3.5 Real-Time PCR 檢測 BMP2、RUNX2、COL-1 miRNA水平 取第四代細胞，按前述實驗分組進行處理。將細胞移入6孔板（2×105個/孔），置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養48 h，分別收集3組的細胞于1．5 ml EP管保留，加入Trizol試劑（日本Takara公司），按試劑盒說明書提取人牙槽骨骨髓干細胞的RNA。取3．0 μL樣本RNA按照M－MLV反轉錄試劑盒的說明來逆轉錄合成cDNA。Real－Time PCR擴增BMP2、RUNX2、COL－1，并將β－actin作為內參照。反應體系如下：采用SYBR Premix Ex Taq 試劑盒，master mix 10．0 μL，上下游引物各 1．0 μL，cDNA 1．0 μL，DDW 2．2 μL 共計 20 μL。反應條件：94 ℃下 270 s、56℃下30 s、72℃下30 s，在完成40個上述循環后，再行數據處理和柱狀圖繪制。成骨相關目的基因的引物由天津賽爾生物技術有限公司合成，引物序列見表1。

1.4 統計學分析

采用SPSS．17．0軟件分析實驗數據，計量資料在經過方差分析后，符合正態分布者以（±s）表示，計數資料則用百分率表示，3組間的細胞增殖情況、基因表達結果比較使用單因素方差分析，3組間數據的兩兩比較使用LSD進行多重比較，P＜0．05為差異有統計學意義。

表1 BMP2、RUNX2、COL－1 和 β－actin 引物設計

2 結果

2.1 原代人牙槽骨骨髓間充質干細胞培養結果

細胞形態學結果發現：第7 d顯微鏡下觀察，有少量細胞從骨屑邊緣溢出，細胞形狀有長梭形、圓形、多角形等多種不同表現，此階段細胞多、較短小；培養第10 d時，鏡下觀察發現星形、紡錘形細胞體積明顯增加，相鄰細胞間有連接，且細胞呈現出明顯長梭形和（或）紡錘形態。上述實驗培養細胞形態與已知的BMSCs貼壁形態基本符合。

2.2 免疫熒光結果

BMSCs細胞表面抗原特點為 CD34（－）、CD44（+）、CD90（+），本實驗中在對樣本進行3次獨立免疫熒光檢測后發現，3次檢測結果均一致，無論是20倍光鏡下還是40倍的熒光顯微鏡下觀察，結果均為：對照組未加入細胞表面抗體，只見細胞核藍色熒光表達；加入CD34表面抗體組，胞質熒光染色強度極弱，呈CD34（－）；加入CD44和CD90表面抗體組染色強度較強，即CD44（+）、CD90（+）。可見本實驗體外培養、分離提取細胞的表面抗原表達結果與骨髓來源BMSCs具有高度一致性，因此，可以認為本實驗所分離培養的細胞類型為BMSCs。

2.3 CCK-8檢測結果

隨機選取樣本，各組樣本數均為5個。結果顯示（見圖1），3組細胞均有增殖，其中第4天實驗組細胞增殖顯著高于空白組及對照組（P＜0．01），第 1、2、3 天實驗組與空白組、對照組細胞增殖情況未見差異（P＞0．05）。第4天對照組與空白組無統計學差異（P＞0．05）。結果提示石墨烯促進細胞增殖。

圖1 CCK－8檢測細胞增殖測定結果

2.4 qRT-PCR檢測結果

利用 qRT－PCR 法對各組 BMP2、RUNX2、COL－1 基因表達情況進行定量分析，通過對3組BMP2、RUNX2、COL－1分別進行組間兩兩比較發現，各組BMP2、RUNX2、COL－1基因表達水平存在顯著性差異（P＜0．01）。BMP2基因表達結果如下：實驗組BMP2基因陽性表達效果顯著高于空白組、對照組（P＜0．01），而對照組 BMP2 基因表達同樣顯著高于空白組（P＜0．01）；RUNX2基因表達結果：實驗組RUNX2基因水平顯著高于空白組與對照組（P＜0．01），對照組的 RUNX2基因水平也顯著高于空白組（P＜0．01）；COL－1 基因表達水平多重比較結果：實驗組的 COL－1 基因表達顯著高于空白組與對照組（P＜0．01），對照組 COL－1基因表達與空白組比較接近（P＞0．05）。見圖2。

圖2 各組BMP2、RUNX2、COL－1基因表達結果比較

3 討論

3.1 原代人牙槽骨骨髓間充質干細胞的分離、培養與鑒定

自體AB－BMSCs作為牙源性干細胞，不僅排斥反應少，移植安全性高，且分離、擴增方便。在實驗中，已證實AB－BMSCs與人原代BMSCs特性一致，具有極強的細胞增殖分化能力[5－6]。目前BMSCs分離獲取方法主要包括密度梯度離心法、組織塊法、流式細胞儀篩選法及免疫磁珠法[7]。本實驗選擇組織塊法進行AB－BMSCs的分離培養，主要考慮該方法不僅操作簡單而且實驗費用低廉、可重復性強，并且能利用BMSCs貼壁的特點將細胞不斷純化，更利于成功獲取高純度AB－BMSCs細胞。

鑒定BMSCs生物學特征方法主要是通過對比細胞形態學表現[8]和檢測細胞表面標記物[9－11]CD34（－）、CD44（+）、CD90（+），說明實驗獲取的為BMSCs。此實驗與上述研究成果一致，所獲取的細胞是AB－BMSCs，AB－BMSCs的分離、純化、培養成功。

3.2 石墨烯促進骨髓間充質干細胞增殖

Kalbacova M等[11]發現使用石墨烯、氧化硅分別對人成骨細胞、間質干細胞進行培養，結果石墨烯上接種的細胞在經過體外培養之后，細胞的增殖效果（增殖率）具有明顯優勢。李中華[12]的研究同樣證實了石墨烯環境誘導下BMSCs在第3天增殖率開始迅速升高。本實驗中，在體外培養獲得AB－BMSCs之后，將AB－BMSCs接種到不同種類的培養皿中，結果發現，在接種密度相同的情況下，石墨烯干預后的第4天AB－BMSCs增殖率最高，增殖率顯著高于空白組和對照組（P＜0．01），說明石墨烯能促進AB－BMSCs增殖，此結果與前人研究的結果一致。作為口腔骨組織修復體，其能很好地與自體骨結合，達到骨重建的目的。

3.3 石墨烯對人牙槽骨骨髓間充質干細胞成骨分化的影響

La W G等[13]在實驗中用石墨烯修飾高分子聚合物，用氧化石墨烯對鈦種植體進行表面修飾，修飾后成骨分化的速度顯著提升，說明石墨烯能夠改善細胞生存環境，對細胞生存、分化提供有力的保障環境。

本實驗中選取了成骨分化相關基因的表達情況作為觀察指標，旨在初步研究石墨烯通過調控成骨相關基因，進一步促進 AB－BMSCs成骨分化。BMP2[14－15]、RUNX2[16－19]、COL－1[20－22]均為促進成骨分化基因，本實驗結果為：實驗組在BMP2、RUNX2、COL－1基因表達明顯高于空白組與對照組（P＜0．01）。研究表明，石墨烯促進細胞成骨分化，與以上實驗結果具有一致性。說明石墨烯不僅能夠作為骨支架材料應用于骨重建，它還可以促進骨形成，更好地應用于臨床。

4 結語

人牙槽骨來源的骨屑能夠培養出的細胞為骨髓間充質干細胞，具有成骨分化能力。石墨烯作為新型材料，能夠對人牙槽骨來源骨髓間充質干細胞增殖及成骨分化產生促進作用，其作用機制可能與石墨烯能夠上調BMP2、RUNX2、COL－1等促成骨分化基因表達水平有關。