小檗胺聯合拉帕替尼對三陰性乳腺癌細胞增殖和凋亡的影響

朱激揚 陳華 徐燕芳

[摘要] 目的 研究小檗胺聯合拉帕替尼對三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖和凋亡的影響。 方法 MTT法檢測不同濃度的小檗胺和拉帕替尼單獨用藥及聯合用藥對三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231的增殖抑制作用;采用CompuSyn軟件分析不同劑量組聯合用藥的聯合指數CI，確定最佳聯合方案;將細胞隨機分為4組：空白對照組、小檗胺組、拉帕替尼組以及聯合用藥組，用篩選出的最佳聯合劑量分別進行藥物干預，流式細胞術檢測各組細胞的凋亡情況。 結果 相對于單獨用藥，小檗胺和拉帕替尼聯合用藥能夠更加顯著地抑制MDA-MB-231細胞增殖，差異有統計學意義（P < 0.05）;CompuSyn軟件分析結果顯示各個劑量聯合用藥的CI值均<1，表明兩藥具有協同抑制的作用，選擇CI值最小的劑量組進行后續實驗;與空白對照組比較，小檗胺組與拉帕替尼組細胞總凋亡率增加，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01），與小檗胺組和拉帕替尼組比較，聯合用藥組細胞總凋亡率增加，差異有統計學意義（P < 0.05）。 結論 小檗胺聯合拉帕替尼能夠增強對三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231的增殖抑制作用以及誘導凋亡作用。

[關鍵詞] 小檗胺;拉帕替尼;三陰性乳腺癌;增殖;凋亡

[中圖分類號] R737.9 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2020）07（b）-0123-04

[Abstract] Objective To investigate the effects of Berberine combined with Lapatinib on proliferation and apoptosis of MDA-MB-231 triple negative breast cancer cells. Methods MTT assay was used to detect the proliferation inhibition of single application for Berberine， Lapatinib and drug combination at different concentrations in MDA-MB-231 triple negative breast cancer cells. CompuSyn software was used to analyze the combined index CI of different dose groups and determine the best combined scheme. The cells were randomly divided into 4 groups： the blank control group， the Berberine group， the Lapatinib group and the drug combination group， and the optimal combination dose selected was used for drug intervention respectively. Flow cytometry was used to detect apoptosis in each group. Results Compared with the single drug， the combination of Berberine and Lapatinib inhibited the proliferation of MDA-MB-231 cells more significantly， and the difference was statistically significant （P < 0.05）. CompuSyn software analysis results showed that the CI value of each combined dose was < 1， indicating that the two drugs had synergistic inhibitory effect. The dose group with the lowest CI value was selected for subsequent experiments. Compared with the the blank control group， the total apoptosis rate of the Berberine group and the Lapatinib group increased， and the differences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）. Compared with the Berberine group and the Lapatinib group， the total apoptosis rate of the combined treatment group was increased， and the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Berberine combined with Lapatinib can enhance the ability of the proliferation inhibition and induce apoptosis of MDA-MB-231 triple negative breast cancer cells.

[Key words] Berberine; Lapatinib; Triple negative breast cancer; Proliferation; Apoptosis

三陰性乳腺癌是指雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）表達均為陰性的乳腺癌，其惡性程度高，侵襲性強，容易出現局部復發和遠端轉移[1]，占所有乳腺癌的15%～23%[2-3]。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）是ErbB酪氨酸激酶受體家族的成員，在細胞遷移和侵襲方面發揮重要作用[4-5]。拉帕替尼（Lapatinib）作為EGFR的靶向抑制劑，單獨使用時的臨床療效不太理想[6-8]。有研究稱[7]，拉帕替尼和伊馬替尼聯合使用雙靶向抑制EGFR和c-Abl能夠有效抑制三陰性乳腺癌細胞的生長。小檗胺（Berbamine）是從小檗屬植物中提取的雙芐異喹啉類生物堿，同樣作為c-Abl的抑制劑[9-10]，其與拉帕替尼聯合使用治療三陰性乳腺癌的研究還鮮有報道。因此，本研究通過體外培養人三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231，分析小檗胺和拉帕替尼單獨用藥與聯合用藥對MDA-MB-231細胞增殖的影響，尋找最佳聯合方案，并選用流式細胞儀觀察聯合用藥對細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞

人乳腺癌細胞MDA-MB-231購自中國科學院上海生命科學學院細胞庫。

1.2 藥材、試劑與儀器

小檗胺（上海詩丹德生物技術有限公司，批號：1933;純度>98.0%），用DMSO配制成50 mmol/L儲存備用;拉帕替尼（GSK，批號：J20180012）;DMEM、胎牛血清（Gibco公司，批號：13100056、1725107）;MTT試劑盒（碧云天，批號：C0010）;Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒（Thermo公司，批號：BMS500F1-201）;超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司，SW-CJ-2FD）;流式細胞儀（Calibur DB，USA）。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養 ?MDA-MB-231細胞株培養于含10%的胎牛血清、青霉素200 U/mL、鏈霉素200 U/mL的完全培養液DMEM中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。每2天換液1次，待80%～90%融合后，以0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3傳代，置37℃、5%CO2培養箱內繼續培養用于后續實驗。

1.3.2 MTT法檢測小檗胺與拉帕替尼單獨及聯合用藥對MDA-MB-231細胞的增殖抑制作用 ?取對數期生長的MDA-MB-231細胞，消化、離心后加入適量培養基重懸細胞，血球計數板計數后，接種至96孔板，每孔加入100 μL細胞懸液，并控制其細胞濃度為3000個/孔，于培養箱中培養18 h至貼壁后，每孔加入10 μL藥物，設置小檗胺濃度梯度為0、15、20、25、30 μg/mL，設置拉帕替尼濃度梯度為0、2、4 μg/mL，每個濃度設置4個復孔，另外設置空白對照組，培養48 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，4 h后每孔加入200 μL三聯液，將96孔板放到外用37℃恒溫培養箱中作用18 h后，用Bio-Rad酶標儀在570 nm條件下測定吸光度OD值，計算單獨用藥和聯合用藥對細胞的抑制率和細胞的相對存活率。

1.3.3 聯合指數及等效線分析法 ?MTT法檢測單獨用藥及聯合用藥對MDA-MB-231細胞生長抑制率，并將計算得到的存活率用聯合用藥軟件CompuSyn分析處理，得到的等效線圖是基于小檗胺與拉帕替尼的計量-反應曲線，其中在等效線下方的數據點提示藥物間有協同作用;在等效線上的數據點提示藥物間屬于疊加作用;在等效線上方的數據點提示藥物間有拮抗作用。

1.3.4 AnnexinV/PI雙染色法檢測細胞凋亡 ?實驗分組：空白對照組、小檗胺組、拉帕替尼組、聯合用藥組。將狀態良好的MDA-MB-231細胞以6×105/孔傳代于6孔板中，等待細胞貼壁之后，按照分組的情況加入藥物，藥物濃度由CompuSyn軟件分析篩選得到，每組設置3個復孔，繼續培養24 h后用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）清洗2遍，用胰酶消化后，用PBS重懸細胞，離心后加入1×Binding buffer 500 μL重懸細胞成細胞懸液，分別加入10 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，避光孵育10 min，采用guava微流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0對所得數據進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間分析采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小檗胺與拉帕替尼單獨及聯合用藥對MDA-MB-231細胞增殖的影響

小檗胺和拉帕替尼均能抑制MDA-MB-231細胞增殖，并且與單獨用藥比較，兩藥物聯合用藥能夠顯著增強對MDA-MB-231細胞的抑制率，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表1。

2.2 CompuSyn軟件分析聯合指數

根據MDA-MB-231細胞在不同濃度的小檗胺和拉帕替尼單獨及聯合作用下的存活率，用CompuSyn軟件分析得到等效線圖及聯合方案的聯合指數CI。所有劑量組聯合用藥數據點均在等效線下方，且CI值均<1，提示兩藥具有協同作用。其中在拉帕替尼4 μg/mL，小檗胺為25 μg/mL時，CI值最小，即聯合效果最佳，以此為最佳聯合方案進行后續實驗。見圖1。

2.3 小檗胺與拉帕替尼單獨及聯合用藥對MDA-MB-231細胞凋亡的影響

采用AnnexinV/PI雙染色法檢測小檗胺（25 μg/mL）與拉帕替尼（4 μg/mL）單獨及聯合用藥對MDA-MB-231細胞凋亡的影響?？瞻讓φ战M、小檗胺組、拉帕替尼組及聯合用藥組的凋亡率分別為5.88%、13.9%、20.33%、27.67%。與空白對照組比較，小檗胺組與拉帕替尼組及聯合用藥組細胞總凋亡率增加，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01），與小檗胺組和拉帕替尼組比較，聯合用藥組細胞總凋亡率增加，差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖2。

3 討論

腫瘤分子靶向治療是指在腫瘤分子生物學和細胞生物學的基礎上，針對可能導致細胞癌變的環節，從分子水平上來逆轉這種惡性生物學行為，從而抑制腫瘤細胞生長，甚至使其完全消退的一種全新的生物治療模式[11]。EGFR在細胞遷移和侵襲方面發揮著重要的作用，并在肺癌、卵巢癌、乳腺癌和結直腸癌等惡性腫瘤中高表達[12-15]。拉帕替尼是同時靶向EGFR和HER2的小分子口服酪氨酸激酶抑制劑，研究顯示，拉帕替尼與化療藥物聯用對食管癌、胃癌及胃食管連接癌均表現出較好的抗腫瘤活性[16]，但在臨床試驗中發現，拉帕替尼單獨使用時的臨床療效卻不太理想[6-8]。非受體酪氨酸激酶c-Abl是一個多功能的原癌基因蛋白，它可以調節細胞的遷移、氧化應激反應以及凋亡。研究顯示[17-18]，在乳腺癌發病機制中，c-Abl表達是一種常見的現象，它在乳腺癌細胞的生長和侵襲中扮演了重要的角色，且與乳腺癌晚期的轉移密切相關，伊馬替尼是目前應用最廣泛的c-Abl抑制劑。有文獻報道[7]，拉帕替尼和伊馬替尼聯合使用雙靶向抑制EGFR和c-Abl能夠有效抑制三陰性乳腺癌細胞的生長。小檗胺作為c-Abl的一個天然抑制劑[9]，由此推測，小檗胺聯合拉帕替尼也能夠抑制三陰性乳腺癌細胞的生長。

小檗胺具有多種生物學功能，包括促進白細胞增生、抗結核、抗心肌缺血缺氧、抗心律失常等[19]，近來有報道稱它可明顯抑制多種惡性腫瘤的細胞增殖，包括白血病細胞、淋巴瘤細胞、骨髓瘤細胞、乳腺癌細胞等[20]。本研究結果顯示，相比于單獨用藥，小檗胺與拉帕替尼聯合用藥能夠更加有效地抑制三陰性乳腺癌的生長，通過生物信息軟件證實兩藥物呈現協同抑制作用，并篩選出最佳聯合方案，流式細胞術證明聯合用藥能夠更顯著地誘導MDA-MB-231細胞的凋亡。本研究提出了一種聯合用藥新思路，并為三陰性乳腺癌的臨床用藥提供了可能的指導。

[參考文獻]

[1] ?Bianchini G，Balko JM，Mayer IA，et al. Triple-negative breast cancer：challenges and opportunities of a heterogeneous disease [J]. Nat Rev Clin Oncol，2016，13（11）：674-690.

[2] ?孫莉，趙毅.三陰性乳腺癌治療的研究進展[J].現代腫瘤醫學，2019，27（13）：2420-2424.

[3] ?尹海慶，蘇莉，陳萬貞，等.術后首發肺轉移的三陰性乳腺癌臨床病理特點及預后因素分析[J].現代腫瘤醫學，2019，27（16）：2872-2876.

[4] ?Wang Y，Zhang J，Ren S，et al. Branched-Chain Amino Acid Metabolic Reprogramming Orchestrates Drug Resistance to EGFR Tyrosine Kinase Inhibitors [J]. Cell Rep，2019，28（2）：512-525.

[5] ?覃咸雄，孫圣榮.CK5/6、EGFR和E-cadhenrin在三陰性乳腺癌中的表達及意義[J].解剖學研究，2018，40（3）：169-173.

[6] ?Powles T，Huddart RA，Elliott T，et al. Phase Ⅲ，Double-Blind，Randomized Trial That Compared Maintenance Lapatinib Versus Placebo After First-Line Chemotherapy in Patients With Human Epidermal Growth Factor Receptor 1/2-Positive Metastatic Bladder Cancer [J]. J Clin Oncol，2017，35（1）：48-55.

[7] ?Wang YL，Overstreet AM，Chen MS，et al. Combined inhibition of EGFR and c-ABL suppresses the growth of triple-negative breast cancer growth through inhibition of HOTAIR [J]. Oncotarget，2015，6（13）：11150-11161.

[8] ?Lorenzen S，Riera Knorrenschild J，Haag GM，et al. Lapatinib versus lapatinib plus capecitabine as second-line treatment in human epidermal growth factor receptor 2-amplified metastatic gastro-oesophageal cancer：a randomised phase Ⅱ trial of the Arbeitsgemeinschaft Internistische Onkologie [J]. Eur J Cancer，2015，51（5）：569-576.

[9] ?唐勁奮.天然產物小檗胺增強伊馬替尼治療慢性粒細胞白血病的療效及機制研究[D].杭州：浙江大學，2014.

[10] ?郭子寒，杜瓊，戴賢春，等.腫瘤分子靶向治療藥物的發展概況[J].上海醫藥，2018，39（5）：5-9.

[11] ?Scharpenseel H，Hanssen A，Loges S，et al. EGFR and HER3 expression in circulating tumor cells and tumor tissue from non-small cell lung cancer patients [J]. Sci Rep，2019，9（1）：7406.

[12] ?Adachi Y，Ohashi H，Imsumran A，et al. The effect of IGF-I receptor blockade for human esophageal squamous cell carcinoma and adenocarcinoma [J]. Tumor Boil，2014， 35（2）：973-985.

[13] ?Elbaz M，Ahirwar D，Ravi J，et al. Novel role of cannabinoid receptor 2 in inhibiting EGF/EGFR and IGF-I/IGF-IR pathways in breast cancer [J]. Oncotarget，2017，8（18）：29668-29678.

[14] ?Xu L，Qi Y，Xu Y，et al. Co-inhibition of EGFR and IGF1R synergistically impacts therapeutically on adrenocortical carcinoma [J]. Oncotarget，2016，7（24）：36235-36246.

[15] ?李賽賽.Lapatinib聯合紫杉醇對食管癌的抗腫瘤活性及作用機制研究[D].新鄉：新鄉醫學院，2018.

[16] ?Morrison CD，Allington TM，Thompson CL，et al. c-Abl inhibits breast cancer tumorigenesis through reactivation of p53-mediated p21 expression [J]. Oncotarget，2016，7（45）：72777-72794.

[17] ?Fu R，Deng Q，Zhang H，et al. A novel autophagy inhibitor berbamine blocks SNARE-mediated autophagosome- lysosome fusion through upregulation of BNIP3 [J]. Cell Death Dis，2018，9（2）：243.

[18] ?呂雨晨，吳苗苗，房坤，等.地高辛對三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡作用的研究[J].中國醫藥導報，2019， 16（36）：14-18，23.

[19] ?Jin X，Wu Y. Berbamine enhances the antineoplastic activity of gemcitabine in pancreatic cancer cells by activating transforming growth factor-beta/Smad signaling [J]. Anatomical record，2014，297（5）：802-809.

[20] ?Zhang H，Jiao Y，Shi C，et al. Berbamine suppresses cell proliferation and promotes apoptosis in ovarian cancer partially via the inhibition of Wnt/β-catenin signaling [J]. Acta Biochim Biophys Sin（Shanghai），2018，50（6）：532-539.

（收稿日期：2020-01-06）