CSF2基因對舌鱗狀細胞癌TCa8113細胞系化療敏感性的影響

林阿隨 蔣萍 沈耀川 謝曉梅 陳昕

【摘要】 目的：探究集落刺激因子2（colony stimulating factor 2，CSF2）對舌鱗狀細胞癌TCa8113細胞系化療敏感性的影響。方法：全轉錄組測序分析順鉑耐藥TCa8113細胞（TCa8113/CDDP）與野生型TCa8113（WT-TCa8113）表達譜，并做差異基因分析。以TCa8113/CDDP細胞株上調程度最高的CSF2基因為候選耐藥基因，通過構建該基因敲低、過表達TCa8113細胞株，探究CSF2對TCa8113細胞對順鉑敏感性的影響。結果：全轉錄組測序結果共篩選出2 077個差異基因，包括1 488個上調基因，589個下調基因。其中，CSF2是TCa8113/CDDP細胞株上調程度最高的基因。細胞毒性試驗結果提示，WT-TCa8113細胞毒染48 h的半數抑制濃度（IC50）為（0.502±0.030）μg/ml，顯著低于TCa8113/CDDP的（6.956±0.370）μg/ml

（P<0.01）。TCa8113/CDDP細胞的耐藥指數（RI）為（13.8±1.34）。CSF2敲低TCa8113/CDDP和CSF2過表達TCa8113/CDDP細胞IC50分別為（0.774±0.120）μg/ml和（9.548±0.550）μg/ml，差異有統計學意義（P<0.01）。結論：CSF2是舌鱗狀細胞癌順鉑耐藥相關基因，抑制CSF2表達能顯著提高TCa8113順鉑敏感性。

【關鍵詞】 集落刺激因子2 舌鱗狀細胞癌 順鉑 耐藥 化療敏感性

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2020.17.072 文獻標識碼 B 文章編號 1674-6805（2020）17-0-04

Effect of CSF2 Gene on Chemosensitivity of Tongue Squamous Cell Carcinoma TCa8113 Cell Line/LIN Asui， JIANG Ping， SHEN Yaochuan， XIE Xiaomei， CHEN Xin. //Chinese and Foreign Medical Research， 2020， 18（17）： -174

[Abstract] Objective： To investigate the effect of colony stimulating factor 2 （CSF2） gene on chemosensitivity of tongue squamous cell carcinoma TCa8113 cell line. Method： Cisplatin-resistant TCa8113 cells （TCa8113/CDDP） and wild-type TCa8113 （WT-TCa8113） expression profiles were analyzed by whole transcriptome sequencing， and the differential gene were analyzed. The CSF2 gene with the highest degree of up-regulation of TCa8113/CDDP cell line was used as a candidate drug resistance gene. By constructing this gene knockdown and overexpressing TCa8113 cell line， the effect of CSF2 on the sensitivity of TCa8113 cells to Cisplatin was explored. Result： The whole transcriptome sequencing results screened out 2 077 differential genes， including 1 488 up-regulated genes and 589 down-regulated genes. Among them， CSF2 was the most up-regulated gene of TCa8113/CDDP cell line. The results of cytotoxicity test indicated that the half inhibitory concentration （IC50） of WT-TCa8113 after 48 hours of infection was （0.502±0.030） μg/ml， which was lower than （6.956±0.370） μg/ml of TCa8113/CDDP cells （P<0.01）. The drug resistance index （RI） of TCa8113/CDDP cells was （13.8±1.34）. IC50 of CSF2 knockdown TCa8113/CDDP and CSF2 overexpression TCa8113/CDDP cells were （0.774±0.120） μg/ml and （9.548±0.550） μg/ml， and the difference was statistically significant （P<0.01）. Conclusion： CSF2 is a Cisplatin resistance-related gene of tongue squamous cell carcinoma. Inhibiting CSF2 expression can significantly increase the sensitivity of TCa8113 to Cisplatin.

[Key words] Colony stimulating factor 2 Tongue squamous cell carcinoma Cisplatin Drug resistance Chemosensitivity

First-authors address： The 73rd Military Hospital of the PLA， Xiamen 361000， China

口腔鱗狀細胞癌是口腔癌中最常見的腫瘤類型，占所有口腔惡性腫瘤的90%以上[1-2]。其中，以舌鱗狀細胞癌（tongue squamous cell carcinoma，TSCC）最為常見[3-4]。近年來多采用術前聯合化療方案以提高手術成功率，減少術后復發。但是，不同個體對相同化療方案表現出的療效差異較大[5-6]。化療耐藥是TSCC治療失敗的最主要原因[7-8]。目前，順鉑耐藥分子機制仍未完全闡明[9]。本研究通過比較順鉑耐藥人舌鱗癌TCa8113細胞株（TCa8113/CDDP）和野生型TCa8113（WT-TCa8113）細胞株的差異表達基因，篩選出CSF2為TCa8113/CDDP與WT-TCa8113細胞表達差異最大的基因。但目前仍未有CSF2基因對TCa8113細胞化療敏感性的相關報道，故本研究通過構建CSF2敲低、過表達TCa8113細胞株進一步探究CSF2對TCa8113對順鉑敏感性的影響，為逆轉舌鱗狀細胞癌順鉑耐藥提供參考。

1 資料與方法

1.1 主要試劑與儀器

DMEM培養基（Thermo Fisher Scientific）;胎牛血清（FBS）;全自動細胞計數儀（Thermo Fisher Scientific）;全蛋白提取試劑盒（杭州弗德生物科技有限公司）;鼠源性CSF2抗體（上海雅酶生物科技有限公司）;HRP標記二羊抗鼠抗體（上海雅酶生物科技有限公司）;高速離心機（beckman coulter，Allegra X-30）;恒溫細胞培養箱（Thermo Fisher Scientific）。

1.2 細胞系及細胞培養

野生型人舌鱗狀細胞癌細胞系TCa8113（WT-TCa8113）、順鉑耐藥TCa8113（TCa8113/CDDP）購買于上海語純生物科技有限公司。CSF2敲低WT-TCa8113（KD-WT-TCa8113）、CSF2過表達WT-TCa8113（OE-WT-TCa8113）、CSF2敲低TCa8113/CDDP（KD-TCa8113/CDDP）和CSF2過表達TCa8113/CDDP（OE--TCa8113/CDDP）由廈門閩博生物技術有限公司構建。上述細胞株均使用10% FBS和1%鏈霉素和青霉素的DMEM培養基于37 ℃、5% CO2的恒溫細胞培養箱中培養。

1.3 順鉑耐藥細胞株的鑒定

取對數生長期的WT-TCa8113和TCa8113/CDDP，胰蛋白酶消化后用新鮮培養基稀釋至1×105/ml，接種于24孔板中培養6 h。待細胞完全貼壁后，更換含有梯度濃度的順鉑的新鮮DMEN培養基，濃度梯度設置為0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、4、8、10 μg/ml。培養48 h后采用全自動細胞計數儀計數各處理組的活細胞數量，以未加藥組（0 μg/ml）為對照組，根據公式[細胞存活率=各梯度濃度處理組活細胞數量/對照組（0 μg/ml）活細胞數量×100%]計算各處理的細胞存活率。根據細胞抑制曲線計算WT-TCa8113和TCa8113/CDDP的半數抑制濃度（IC50）。耐藥指數（RI）計算公式為：耐藥細胞系的IC50/野生型細胞系的IC50。

1.4 野生型TCa8113和順鉑耐藥TCa8113全轉錄組測序及表達譜分析

將上述經過鑒定的WT-TCa8113和TCa8113/CDDP送于上海天昊生物科技有限公司進行高通量轉錄組測序。mRNA表達量計算經比對、比較、標準化三個過程。利用HTSeq計算Read Count值。mRNA表達量以RPKM（reads per kilobase per million mapped reads）表示。分析WT-TCa8113和TCa8113/CDDP的差異表達mRNA，以|log2FoldChange|≥1，調整后P值<0.05為差異表達基因。最后，對差異表達的基因進行KEGG Pathway富集分析及人類基因功能（Gene Ontology，GO）富集分析，分析差異表達基因參與的生物學過程和通路，尋找可能的作用機制。P<0.05為篩選閾值。

1.5 WesternBlot檢測細胞CSF2蛋白表達量

取指數生長期細胞，胰蛋白酶消化后，PBS重懸制備細胞懸液。全蛋白提取試劑盒提取細胞全蛋白后Western Blot試驗檢測各細胞CSF2蛋白表達量。

1.6 統計學處理

實驗數據均采用SPSS 20.0軟件進行統計分析，計量資料以（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。細胞的半數抑制濃度（IC50）由Graphpad Prism v8.2軟件計算，統計圖均采用Graphpad Prism v8.2統計學軟件制作。

2 結果

2.1 WT-TCa8113和TCa8113/CDDP細胞株對順鉑敏感性分析

梯度濃度（0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、4、8、10 μg/ml）順鉑培養基培養48 h后，WT-TCa8113和TCa8113/CDDP細胞株的細胞存活率隨著順鉑濃度的增加而逐漸降低，見圖1。WT-TCa8113細胞株的IC50為（0.502±0.030）μg/ml，顯著低于TCa8113/CDDP細胞株的（6.956±0.370）μg/ml，差異有統計學意義（t=-30.114，P<0.01）。TCa8113/CDDP細胞的耐藥指數（RI）為（13.80±1.34）。

2.2 WT-TCa8113和TCa8113/CDDP細胞株基因差異表達分析

通過生物信息學方法，共篩選出差異表達基因2 077個，其中TCa8113/CDDP上調基因1 488個（右上區域），下調基因589個（左上區域），見圖2。根據差異倍數進行排序。TCa8113/CDDP對比WT-TCa8813，表達量差異最大的上調基因分別為CSF2、NMES1、NOG、SERPINB13、TCRP1、DKK1、FGD3、MMP11、PTHL、HSPP1;表達差異最大的下調基因分別為KRT4、CRNN、MUC21、MAL、ACTA1、TGM3、KRT13、CRISP3、MYL1、SPRR3。

2.3 CSF2敲低、過表達細胞株CSF2蛋白表達量檢測

WesternBlot試驗檢測6株TCa8113細胞CSF2蛋白表達水平，順鉑耐藥株TCa8113/CDDP的CSF2蛋白表達量較野生型WT-TCa8113高，見圖3A。對3次獨立試驗的結果做半定量灰度分析顯示，在WT-TCa8113組中，OE-WT-TCa8113 CSF2蛋白表達量較WT-TCa8113高，KD-WT-TCa8113 CSF2蛋白表達量較WT-TCa8113低，差異均有統計學意義（P<0.01）;在TCa8113/CDDP組中，OE-TCa8113/CDDP CSF2蛋白表達量較TCa8113/CDDP高， KD-TCa8113/CDDP CSF2蛋白表達量較TCa8113/CDDP低，差異均有統計學意義（P<0.01），見圖3B。

2.4 CSF2表達對TCa8113細胞順鉑敏感性的影響

細胞毒性試驗結果顯示，WT-TCa8113、KD-WT-TCa8113和OE-WT-TCa8113的IC50分別為（0.543±0.040）、（0.327±0.020）、（3.500±0.320）μg/ml，KD-WT-TCa8113的IC50顯著低于WT-TCa8113，OE-WT-TCa8113的IC50顯著高于WT-TCa8113，差異均有統計學意義（P<0.05），見圖4A。TCa8113/CDDP、KD-TCa8113/CDDP和OE-TCa8113/CDDP的IC50分別為（6.539±0.470）、（0.774±0.120）、（9.548±0.550）μg/ml，

KD-TCa8113/CDDP的IC50顯著低于TCa8113/CDDP，OE-TCa8113/CDDP的IC50顯著高于TCa8113/CDDP，差異均有統計學意義（P<0.05），見圖4B。

3 討論

本研究，通過分析人舌鱗狀細胞癌TCa8113及順鉑耐藥TCa8113的全轉錄組的表達差異，篩選出CSF2基因在耐藥TCa8113細胞中表達高度上調，故考慮其為潛在的順鉑耐藥相關基因。目前，CSF2對舌鱗狀細胞癌的發生、發展仍未見報道。本研究首先采用WesternBlot試驗檢測野生型TCa8113與順鉑耐藥株的CSF2表達情況，結果提示，順鉑耐藥株CSF2表達量較野生型TCa8113明顯升高。通過構建CSF2敲低、過表達細胞株，進一步驗證篩選出來的候選基因對舌鱗狀細胞癌TCa8113細胞系的影響。本研究首次報道敲低CSF2能顯著提高野生型TCa8113順鉑化療敏感性。不僅如此，對于順鉑耐藥TCa8113/CDDP細胞株，敲低CSF2后，也可顯著提高其順鉑敏感性，即可實現耐藥逆轉。

目前，已有數篇研究表明，高表達CSF2與腫瘤的進展有關[10-14]。例如，Lee等[10]報道，CSF2在尿路上皮癌中高表達，高表達CSF2的尿路上皮癌患者預后更差。Jiang等[11]發現，在胃癌中，高表達CSF2能促進腫瘤增殖、遷移和血管生成，與預后不良有關。Lawicki等[14]發現，三陰性乳腺癌的CSF2表達較非三陰性乳腺癌高。三陰性乳腺癌組織通過分泌CSF2，促進巨噬細胞在乳腺癌組織中的聚集，從而進一步促進三陰性乳腺癌的侵襲性。然而，據筆者所知，目前仍未有CSF2基因在舌鱗狀細胞癌中的表達及其表達對舌鱗狀細胞癌發生、發展相關性的研究。本研究初步鑒定了CSF2基因與舌鱗狀細胞癌順鉑耐藥相關，后續將進一步探究CSF2參與舌鱗狀細胞癌發生、發展及對順鉑耐藥的分子機制，為逆轉舌鱗狀細胞癌順鉑耐藥的基礎研究及臨床應用提供理論依據。

參考文獻

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