APN-AMPK信號通路調節骨代謝作用于激素性股骨頭壞死的機制研究

張翔　吳泱　董曉俊　張鴻振　王蕭楓　梅凌　張濤

[摘要] 目的 通過觀察激素性骨壞死模型造模前后骨代謝變化，闡述干預APN-AMPK信號通路調節骨壞死的作用機制。 方法 共20只健康成年白兔，隨機分為正常組和造模組，每組10只，應用LPS聯合醋酸潑尼松龍誘導激素性股骨頭壞死模型，療程為9周。實驗過程中記錄動物一般情況，造模前后分別對所有兔耳緣靜脈取血2 mL，進行ELISA檢測;通過病理組織學檢查確定造模成功，同時分別進行骨細胞AMPK mRNA表達、TNF-α/OPG相關性分析。 結果 造模后，造模組兔血漿APN水平（2.49±0.48）ng/mL，較同組造模前（6.74±0.04）ng/mL比較明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）;造模組兔骨細胞AMPK mRNA表達為（0.364±0.017），較造模前顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）。此外，血清APN含量和AMPK mRNA表達與OPG含量呈正相關性，與TNF-α表達呈負相關性。 結論 脂聯素體內含量可直接引起骨壞死疾病進程，也許APN-AMPK信號通路在疾病轉歸過程中承擔重要角色，通過干預APN-AMPK信號通路正向傳導，可以為臨床治療激素性股骨頭壞死提供新的思路和方法。

[關鍵詞] 激素性股骨頭壞死;APN-AMPK信號通路;動物模型;機制研究

[中圖分類號] R580 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2020）21-0035-05

Study on mechanism of APN-AMPK signal pathway regulating bone metabolism in steroid-induced femoral head necrosis

ZHANG Xiang1 ? WU Yang2 ? DONG Xiaojun3 ? ZHANG Hongzhen1 ? WANG Xiaofeng1 ? MEI Ling3 ? ZHANG Tao4

1.Department of TCM Orthopedics，Wenzhou Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine in Zhejiang Province， Wenzhou ? 325000， China; 2.Internal Medicine of TCM，Wenzhou Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine in Zhejiang Province， Wenzhou ? 325000， China; 3.Department of Orthopedics， Wuhan Hospital of ?Traditional Chinese Medicine， Wuhan ? 430014， China; 4. Hubei University of Traditional Chinese Medicine， Wuhan ? 430014， China

[Abstract] Objective To expound the mechanism of regulating osteonecrosis by intervening APN-AMPK signal pathway through observing the changes of bone metabolism before and after the modeling of steroid-induced femoral head necrosis. Methods A total of 20 healthy adult rabbits were randomly divided into the normal group and the model group，with 10 rabbits in each group. LPS and prednisolone acetate were used to induce the steroid-induced femoral head necrosis. The course lasted for 9 weeks. During the experiment，the general conditions of the animals were recorded. Two ml of blood was taken from the ear veins of all rabbits before and after the modeling，and ELISA was performed. Histopathological examination was conducted to determine the success of the modeling. In the meantime， how the AMPK mRNA expression in the bone cells was correlated with the level of TNF-α and the level of OPG was also analyzed respectively. Results The plasma APN level of rabbits in the model group after modeling （2.49±0.48）ng/mL was significantly lower than that before modeling（6.74±0.04） ng/mL， the difference was statistically significant（P<0.05）. The AMPK mRNA expression in the rabbit bone cells in the model group after modeling（0.364±0.017）was significantly lower than that before modeling， the difference was statistically significant（P<0.05）. In addition，the serum APN content and AMPK mRNA expression were positively correlated with OPG content and negatively correlated with TNF-α expression. Conclusion The content level of adiponectin can directly trigger the progression of osteonecrosis. Perhaps the APN-AMPK signal pathway plays an important role in the process of disease progression. By intervening in the positive conduction of the APN-AMPK signal pathway， new ideas and methods can be generated for the clinical treatment of steroid-induced femoral head necrosis.

[Key words] Steroid-induced femoral head necrosis; APN-AMPK signal pathway; Animal model; Study on mechanism

股骨頭缺血性壞死（Avascular necrosis of femoral head，ANFH）是一種累及骨的漸進破壞，最終導致軟骨下骨塌陷和髖關節損傷的疾病。這種疾病是一個日益嚴重的全球健康問題，美國每年確診ANFH患者2～3萬例[1]，而中國15歲以上ANFH患者有812萬[2-3]。激素性股骨頭壞死（SANFH）是ANFH中較為常見的一種類型，誘因源自于大量使用糖皮質激素，國內外研究顯示SANFH發病率已占該病種首位[4-5]，研究SANFH治療轉歸一直是國內外學者的焦點。AMPK被認為是體內的一類能量傳感器，可維持體內穩態[6]，在機體中通過AMPK信號通路可干預細胞能量代謝，調節糖脂代謝，促進能量代謝趨于平衡。通過改善體內脂聯素（Adiponectin，APN）血漿濃度，促進AMPK信號通路正向傳導，加強脂質代謝，從而對血管內皮起到保護和改善細胞凋亡作用[7-8]。因此，干預APN-AMPK信號通路在調控激素性股骨頭壞死轉歸過程中具有正向作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

成年新西蘭大耳白兔20只，每只體重（2.5±0.2）kg，雌雄各半，所有動物實驗均經武漢市中醫醫院醫學倫理委員會批準進行[9]，并由藥學實驗基地提供[動物許可證號：SKXK（鄂）2010-0056]。

1.2 實驗試劑

主要包括：TRIZOL 試劑盒（Invitrogen Company）;熒光定量PCR試劑盒（Bio-Rad 公司，批號1725201）;反轉錄試劑盒（Takara 公司）;兔腫瘤壞死因子免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）;兔脂聯素（ADP）ELISA 試劑盒（上海亞培生物科技有限公司）;此外，40%甲醛溶液、10%水合氯醛溶液/中性樹脂封固劑等輔助試劑等均由武漢市中醫醫院藥學實驗研究基地提供。

1.3 方法

1.3.1 造模方法 ?于2014年11月～2018年6月在武漢市中醫醫院藥學實驗研究基地國家中醫藥管理局三級實驗室完成，由作者與導師董曉俊教授團隊一同組織完成，采用內毒素聯合糖皮質激素法造模[10]。

1.3.2 分組方法 ?動物實驗室采用恒溫系統，定時喂養1周，然后隨機分為正常組和造模組，每組10只。造模組采用內毒素聯合激素造模方法：造模開始第1天首先采用耳緣靜脈注射LPS（10 μg/kg，美國Sigma公司，批號111M4035V），24 h后重復給藥;第2次注射LPS立即醋酸氫化潑尼松龍8 mg/kg（浙江仙琚制藥股份有限公司，125 mg/支，批號H33020824）臀肌注射，注射3周，停藥3周，繼續用藥3周。正常組與造模組在相同實驗時間點注射等量生理鹽水。兩組動物均單籠標準化飼養，第9周末在正常組和造模組隨機抽取2只兔拍股骨頭正位片，觀察股骨頭囊性變區域和防止股骨頭塌陷。研究期間，所有動物采用青霉素鈉8.0×105 U/kg肌注（哈藥集團制藥總廠，80萬U/支，批號A080700411），每周2次。

1.3.3 取材和組織學切片 ?血液樣本：造模前后經耳緣靜脈對所有兔取血，離心取上層血清液保存。所有兔在實驗第9周末處死，處死后迅速解剖出兔左側股骨，利用鋸條將兔股骨干分成數塊，每塊長約1.5 mm，剔除骨外膜，用PBS將髓腔沖洗干凈，再用錫紙包裹骨組織。先將骨組織置于-75℃冰箱中12 h，再投入液氮中保存。將右側股骨頭沿冠狀面切開，固定，脫鈣，石蠟包埋，連續切片，厚度4 μm，進行HE染色在光鏡下觀察組織形態。

1.4 觀察指標

1.4.1 病理組織學檢查 ?光鏡下觀察組織學切片，觀察骨小梁鏡下變化，并進行相關計數，同時對單位體積內空骨陷窩率進行測算。

1.4.2 兔脂聯素（APN）ELISA指標 ?造模前后分別對所有兔進行耳緣靜脈采血2 mL，然后立即離心取上層血清液保存。實驗結束后按照ELISA試劑盒（上海亞培生物科技有限公司）說明書進行酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測：收集兔耳緣靜脈取2 mL，血清：1000×g離心10 min將血清和紅細胞迅速小心分離。血漿：1000×g離心30 min去除顆粒。細胞上清液：1000×g離心10 min去除顆粒和聚合物。使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產生加樣上的誤差。加入稀釋好后的標準品50 μL于反應孔，加入待測樣品50 μL于反應孔內。立即加入50 μL的生物素標記的抗體，蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1 h。甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30 s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。每孔加入80 μL的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30 min。甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30 s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。每孔加入底物A、B各50 μL，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10 min，避免光照，取出酶標板，迅速加入50 μL終止液，加入終止液后應立即測定結果。在450 nm波長處測定各孔的OD值。

1.4.3 股骨頭局部TNF-α/OPG免疫組化檢測 ?將樣本、試劑和標準品加入37℃反應30 min，隨后洗板5次;加入酶標實際，37℃反應30 min;再次洗板5次，加入顯色液，37℃顯色10 min，最后加入終止液，15 min之內讀取OD 值，進一步計算。

1.4.4 兔股骨頭骨細胞中AMPK mRNA表達 ?將取材的兔股骨頭組織取出，向兔股骨頭組織中加入1 mL TRIZOL裂解液裂解細胞，按照invitrogen TRIZOL說明書進行RNA提取：向兔股骨頭組織中加入1 mL TRIZOL裂解液裂解細胞，用移液槍反復輕柔吹打使細胞裂解。轉移細胞至1.5 mL EP管中加入氯仿0.2 mL，充分混勻，室溫孵育2 min，4℃低溫離心機 12 000 r/min離心10 min。棄去上清液后加入75%的乙醇1 mL，清洗沉淀，12 000 r/min下離心2 min。去除乙醇溶液，室溫下干燥沉淀物 5～10 min，加入去離子水，溶解沉淀。取3 μL細胞總RNA采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA，然后用紫外凝膠成像系統觀察，判定RNA完整性。取逆轉錄試劑盒試劑，測量各RNA濃度，取普通八連管，加入體系：（1）5×primescript RT Enzyme MIX 2 μL/4 μL;（2）Total RNA 500 ng/1 μg（按體系計算體積）;（3）RNase Free ddH2O up to 10 μL/up to 20 μL于普通PCR儀上進行逆轉錄（37℃ 15 min，85℃ 15 s，4℃ forever）。根據NCBI公布的AMPK基因序列分別設計AMPK-R作為q-PCR引物，內部參照（內參）基因為肌動蛋白（Actin），引物為ActR，引物序列見表1。

1.5 統計學分析

采用SPSS19.0統計學軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗;兩變量相關性以Pearson相關系數r表示。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組動物一般觀察比較

造模第2天造模組兔即出現神志萎靡癥狀，第4周均出現食欲不振，體重明顯減輕，步態異常，活動明顯減少，可見脫毛現象;至第9周末大部分兔子出現站立困難，跛行。正常組動物未出現明顯異常，兩組兔均無脫失。

2.2 兩組動物血漿APN水平比較

造模前分別對兩組兔血漿APN水平進行檢測，造模前兩組血漿APN水平比較差異無統計學意義（P>0.05）;造模后，正常組兔血漿APN水平（6.41±0.36）ng/mL，較同組造模前差異無統計學意義（P>0.05）;造模組兔血漿APN水平（2.49±0.48）ng/mL，較同組造模前比較水平明顯降低，且明顯低于正常組，差異有統計學意義（P<0.05），說明糖皮質激素可影響兔血漿APN水平，從而引起骨壞死，見表2。

2.3 兩組動物病理組織學檢查比較[11]

造模組HE染色切片和組織形態學觀察顯示骨小梁減少，密度降低，局部骨小梁連續性中斷。骨細胞核固縮，空骨陷窩明顯增多。骨髓腔內有新出血區，骨髓腔內脂肪細胞增多，骨壞死顯著，正常組未見明顯異常，見封三圖2～3。造模組空骨陷窩率較對照組明顯升高，說明股骨頭骨組織破壞較大（P<0.01），見表3。根據早期激素性股骨頭壞死的病理學判斷標準[12-13]，可確定兔早期激素性股骨頭壞死模型成功建立。

2.4 兩組動物X線檢查結果比較

造模完成后，隨機在正常組和造模組中抽取2只實驗兔進行X線片檢查，造模組可見股骨頭密度不均勻，骨小梁模糊，正常組未見明顯異常，說明造模成功，見圖1。

2.5 兩組動物股骨頭骨細胞AMPK mRNA表達比較

造模前，所有兔骨細胞AMPK mRNA表達檢測結果顯示無明顯差異（P>0.05）;實驗9周末，造模組兔骨細胞AMPK mRNA表達為（0.364±0.017），較造模前顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）。說明激素性骨壞死可導致兔股骨頭骨細胞中AMPK mRNA表達明顯減少，見圖2。

2.6 造模組造模前后TNF-α/OPG 免疫組化IOD值比較

造模前后分別對造模組進行TNF-α/OPG免疫組化檢測，造模后兔股骨頭壞死區域內TNF-α炎性因子表達呈強陽性，IOD值較造模前明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）。同時，造模后壞死區域內OPG表達降低，IOD值較造模前顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）。見表4。

2.7 造模組APN-AMPK信號通路與TNF-α/OPG相關性分析

分析APN-AMPK信號通路與TNF-α/OPG相關性，可見血清APN含量和AMPK mRNA表達與OPG含量呈正相關性，與TNF-α表達呈負相關性，見表5。

3 討論

脂肪組織是一種特殊的能量儲存器官，分泌促炎細胞因子，合成多種脂肪因子，調節其他組織的生理功能[14]。在這些脂肪因子中，脂聯素（APN）又稱Acrp30、apM1和adipoQ，最初被認為是一種脂肪特異性蛋白，主要是由分化的脂肪細胞分泌。隨著現代研究的深入，APN已成為脂肪細胞最豐富的生化產物，具有影響能量平衡、干預胰島素敏感性、血管粥樣硬化轉歸和改變炎癥反應等作用。以往研究顯示，APN是能量消耗和代謝的調節因子，但是最近觀點認為APN可參與機體炎癥反應和細胞凋亡過程[15-16]，已有學者指出APN可促進骨髓間充質干細胞（BMSCs）的成骨及骨缺損的修復[17];也有學者通過應用APN干預大鼠腦缺血再灌注損傷模型，可有效改善損傷進程[18]。眾所周知，激素性股骨頭缺血性壞死誘因源自于大量使用糖皮質激素，導致股骨頭脂質代謝異常，以及血管結構和功能破壞。已有研究證實刺激APN基因adipoq表達，可調節股骨頭局部血管重建[19-20]。除此之外，APN能夠通過減少糖異生而減少甘油三酯的積累[21]，對激素性股骨頭壞死的結構重建起到重要作用。通過本次實驗發現，APN在激素性股骨頭壞死血管重建和結構改善進程中承擔了重要角色，通過干預體內APN水平或許能夠為治療激素性股骨頭壞死提供新的方法。

腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是一個異源三聚體蛋白，普遍存在于真核生物中，由催化亞基α、調節亞基β和γ三個亞基組成[22]。能被AMP與ATP 的比值變化所把控，廣泛參與機體內代謝和能量需要[23]。研究顯示，AMPK的α亞基在骨骼肌、心肌和肝臟中廣泛表達，可以通過增強骨骼肌對糖脂類的攝取，干預脂肪組織和葡萄糖的轉化，從而維持機體內環境的穩定。

通過本次研究，能夠驗證APN是AMPK的激活劑之一[24]，造模組動物造模后血漿APN濃度明顯降低，說明糖皮質激素能夠降低APN含量，進而作用于AMPK信號通路負向傳導，減低脂質代謝。此外，通過本次研究發現，骨壞死兔模型中AMPK mRNA表達明顯較造模前降低，同時TNF-α/OPG免疫組化指標也相應的出現波動，因此在激素性股骨頭壞死模型構建過程中，由于糖皮質激素堆積引起AMPK酶活性降低，降低AMPK信號通路正向傳導，加劇骨壞死的形成。以往研究表明AMPK的激活會引起成骨細胞的分化和礦化[25-26]，促進骨髓間充質干細胞介導的骨修復過程，本次研究能夠證實通過干預APN-AMPK信號通路也許是治療激素性股骨頭壞死的潛在方法。

綜上，脂聯素體內含量可直接引起骨壞死疾病進程，也許APN-AMPK信號通路在疾病轉歸過程中承擔重要角色，如果通過干預體內APN含量，誘導APN-AMPK信號通路正向傳導，能夠有效降低股骨頭壞死區域炎癥反應，降低血脂，進而保護血管內皮細胞、促進骨組織結構修復，這可能成為治療激素性股骨頭壞死的新的思路和方法。

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（收稿日期：2019-09-10）