胃癌組織中FOXP3在不同部位表達與臨床病理特征及預后的相關性

郭天威，張 閩，劉志菊，郭凌川，段衛明，季月霞，曹 磊

目前，胃癌是全球發病率位居第4位、病死率位居第2位的惡性腫瘤[1]。胃癌治療以手術為主，聯合放、化療等綜合治療。近年精準靶向治療越來越引起專家和學者的重視，免疫治療已成為胃癌治療的研究熱點。已有研究證實FOXP3、CTLA-4、PD-L1、B7-H3等免疫分子的表達與胃癌發展、轉移及預后相關，改變免疫分子的表達水平可以干擾胃癌的發展[2]。

FOXP3是叉頭蛋白家族成員之一，是一種對調節性T細胞形成及其免疫抑制功能起重要作用的轉錄因子[3]。FOXP3是Treg細胞的特異性標志物，但Treg細胞在功能和表型呈多樣性[4-5]，腫瘤微環境中FOXP3+T細胞存在多種表型異質性，在不同腫瘤中的FOXP3表達以及發揮的功能可能不同。因此，探討胃癌組織中不同部位的FOXP3表達與臨床病理特征及患者預后的關系有重要的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料收集2009～2011年蘇州大學附屬第一醫院胃癌手術切除標本，經病理確診為胃腺癌的患者268例。制作組織芯片，芯片中每個標本取2個點，癌周和癌巢各取1點。268例患者中有隨訪資料的198例，失訪70例。

1.2 主要試劑兔抗人單克隆抗體FOXP3(濃度稀釋比1 ∶400，克隆號1054C，R&D Systems公司)；鼠抗人單克隆抗體CD4(克隆號UMAB64，北京中杉金橋公司)。HRP標記鼠/兔通用型二抗(即用型，福州邁新公司)；綠熒光染料(fluorescein System，PerkinElmer，USA)；紅熒光染料(Cyanine 3 System，PerkinElmer，USA)；應用免疫組化EnVision法染色。

1.3 主要儀器Dmetrix遠程醫療圖像處理系統、全自動免疫組化檢測儀(羅氏公司)，全自動多功能染色機(ST5020，徠卡公司)，全自動封閉式脫水機(TSJ-Q，常州中威公司)，全自動封片機(CV5030，徠卡公司)，熒光顯微鏡(Olympus公司)。

1.4 免疫組化檢測(1)將包埋制作好的組織芯片蠟塊切成3～5 μm薄片，黏附至防脫片；(2)65 ℃烘片1 h，置于二甲苯中10 min×2次；(3)經無水乙醇清洗5 min×2次，90%、80%、70%梯度乙醇清洗，ddH2O各5 min；(4)檸檬酸緩沖液(1 L，pH 6.0)置于高壓鍋煮沸，玻片放入高壓鍋煮沸3 min，自然冷卻；(5)ddH2O洗3次，每次5 min；(6)室溫3%H2O2溶液浸泡15 min；(7)PBS(pH 7.2)緩沖液浸泡3次，每次5 min；(8)加封閉液濕盒內37 ℃封閉1 h；(9)PBS 緩沖液浸泡3次，每次5 min；(10)加一抗，濕盒內4 ℃過夜；(11)再次PBS緩沖液中浸泡3次，每次5 min；(12)加二抗，室溫孵育1 h；(13)PBS緩沖液中浸泡3次，每次5 min；(14)DAB顯色；(15)ddH2O漂洗5 min，蘇木精襯染后自來水沖洗玻片；(16)65 ℃烤箱烘干，中性樹膠封固。

1.5 雙色免疫熒光檢測(1)步驟同1.4免疫組化檢測步驟前13步，其中第10步的一抗為FOXP3；(2)加熒光染料(綠熒光)，室溫避光10 min；(3)PBS緩沖液中浸泡3次，每次5 min；(4)進行第二次抗原修復；(5)加一抗CD4，37 ℃孵育1 h；(6)PBS緩沖液中浸泡3次，每次5 min；(7)加二抗(HRP標記鼠/兔通用型二抗)；(8)PBS緩沖液中浸泡3次，每次5 min；(9)加熒光染料(紅熒光)，室溫避光10 min；(10)PBS緩沖液中浸泡3次，每次5 min；(11)加DAPI，在熒光顯微鏡下觀察。

1.6 結果判斷組織芯片經免疫組化染色后，應用Dmetrix掃描系統掃描成數字切片，由兩位高年資病理醫師采用雙盲法閱片。在低倍(100×)、高倍(400×)鏡下觀察癌周與癌巢部位染色強度，細胞核或胞膜或胞質呈棕黃色顆粒為陽性(FOXP3為細胞核著色，CD4為胞膜、胞質著色)，均要進行評估。根據陽性細胞百分比計分：無陽性細胞數為0分，<10%為1分，10%～50%為2分，>50%為3分；其中，0～1分為低表達，2～3分為高表達。

1.7 統計學分析采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，利用Pearson χ2檢驗分析胃癌的癌周與癌巢FOXP3表達與臨床病理特征的關系；用Pearson相關分析癌周與癌巢FOXP3與CD4表達的關系；運用Kaplan-Meier作生存分析，兩組曲線之間的比較采用Log-rank檢驗，用Cox回歸分析兩組FOXP3表達與預后的關系，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌中FOXP3的表達本組HE染色示癌周浸潤邊緣的免疫細胞聚集成片(圖1A)或線性排列(圖1B)；癌巢免疫細胞灶性聚集于腫瘤間質內(圖1C)或散點狀分布于腫瘤間質中(圖1D)。免疫組化染色示FOXP3在胃癌組織中有癌周和癌巢兩種浸潤表達方式，癌周表達以片狀聚集、線狀分布為主；癌巢表達以灶性聚集，散在、點狀分布為主。其中癌周免疫細胞片狀聚集處FOXP3高表達(圖1E)，線性分布處免疫細胞FOXP3低表達(圖1F)；癌巢免疫細胞小灶性聚集處FOXP3高表達(圖1G)，間質散點狀分布處FOXP3低表達(圖1H)。

2.2 胃癌中FOXP3表達與臨床病理特征的關系FOXP3在癌周表達與患者死亡差異有統計學意義(P=0.01)；FOXP3在癌周低表達患者中病死率更高(99.2%vs37.9%)，與其它臨床病理特征(患者年齡、性別、分化程度、腫瘤分期、遠處轉移、死亡等)無統計學意義。與癌周表達不同，FOXP3在癌巢的表達與腫瘤大小以及淋巴結轉移差異有統計學意義(P=0.02，P=0.043)；癌巢FOXP3低表達的病例中更容易出現淋巴結轉移，同時腫瘤最大徑超過5 cm的患者更多，與其它臨床病理特征差異無統計學意義(表1)。

表1 胃癌中FOXP3在癌周和癌巢表達與臨床病理特征的關系

2.3 Kaplan-Meier生存分析FOXP3在癌周表達的Kaplan-Meier生存分析結果顯示：癌周FOXP3表達與患者生存呈正相關(P=0.02)，即低表達的患者具有更差的生存期。癌巢FOXP3表達與患者生存無顯著相關性(P=0.625，圖2)。

ABCDEFGH

圖2 FOXP3在癌周和癌巢表達與患者生存分析：A.癌周FOXP3表達患者術后生存曲線；B.癌巢FOXP3表達的患者術后生存曲線

2.4 Cox單因素與多因素分析Cox單因素分析顯示癌周FOXP3表達有降低死亡風險的趨勢(HR=0.637，P=0.022)。Cox多因素分析顯示腫瘤分期升高有死亡風險的趨勢(HR=2.162，P<0.001)；癌周FOXP3表達具有降低死亡風險趨勢(HR=0.665，P=0.043，表2)。

表2 Cox單因素與多因素分析

2.5 不同部位FOXP3表達與CD4表達的相關性FOXP3與CD4的表達相關性分析顯示，癌周表達的FOXP3與CD4的表達之間存在顯著的正相關性(P=0.001)，而癌巢FOXP3表達和CD4表達之間無顯著相關性(表3)。

表3 癌周與癌巢中FOXP3的表達與CD4的相關性

2.6 不同部位FOXP3表達與CD4免疫熒光共定位分析利用雙色免疫熒光的方法檢測癌周的FOXP3和CD4共表達，結果顯示癌周表達的FOXP3陽性細胞有45%±18.8%表達CD4(圖3)，而癌巢表達的FOXP3陽性細胞僅有18.5%±7.6%表達CD4(圖4)。

3 討論

FOXP3被認為是Treg細胞最特異的生物學標記，在其分化、維持及免疫抑制功能方面起至關重要的作用[6]。Treg在機體的腫瘤免疫中主要發揮免疫抑制作用, 在免疫應答中經過TCR介導的信號刺激后能抑制B細胞、CD4+T細胞，CD8+T細胞的活化和增殖。但隨著研究的深入，發現FOXP3+T細胞存在高度異質性，其在不同的腫瘤、不同部位及不同細胞中的表達發揮迥異的免疫功能。多數研究顯示FOXP3+細胞和Treg相關，提示患者預后不良[7]。Nakayama等[8]在非特指性彌漫大B細胞淋巴瘤中的研究顯示，腫瘤內FOXP3+Treg細胞提示預后更差，O’Callaghan等[9]的研究顯示非小細胞肺癌中局灶浸潤FOXP3+T細胞提示預后不良，沈吟芳等[10]研究同樣顯示肺癌微環境中FOXP3+Treg參與肺癌的進展和免疫逃逸。但也有多項研究顯示FOXP3高表達患者具有更好的預后，Yeong等[11]在164例乳腺癌中的研究顯示，腫瘤內存在高密度FOXP3+Treg的患者總生存期和無瘤生存期明顯更長。另一項乳腺癌的研究顯示，高密度FOXP3+腫瘤浸潤性淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocytes, TIL)浸潤與ER-乳腺癌的良好預后相關[12]。此外，研究顯示Ⅰ+Ⅱ期的結直腸癌中FOXP3+的T細胞高密度浸潤均與良好的預后相關[13-14]。鄭珂等[15]在EBV相關性胃癌中的研究結果示FOXP3+和CD8+淋巴細胞高浸潤組比低浸潤組腫瘤浸潤深度淺，脈管內癌栓形成率較低，5年生存率高，提示患者預后良好。同一類腫瘤不同部位FOXP3+TIL存在功能異質性：乳腺癌癌周FOXP3+TIL降低是化療后病理完全緩解的獨立預測因子，而癌巢內FOXP3+TIL在化療后與患者的總生存期和無進展生存期相關[16]。上述研究結果提示不同部位FOXP3的表達對臨床腫瘤患者的病理特征、預后等指標的影響也不同。

③A③B③C③D④A④B④C④D

FOXP3不僅在TIL表達，在腫瘤細胞中也表達，并且在癌細胞核內和胞質的表達功能不同，FOXP3在細胞核的表達是改善乳腺癌總生存率的獨立預測因素，而FOXP3在細胞質的表達意義尚未明確[17]。BT549乳腺癌細胞系中的一項研究發現，FOXP3可以通過直接與啟動子結合抑制SATB1基因表達或是通過產生2個miRs(miR-7及miR-155)來沉默該基因[18]。這些研究均提示FOXP3在乳腺癌發生、發展中起抑制作用。另一些研究顯示早期胃癌腫瘤細胞中FOXP3的表達與較好的預后相關，同樣提示FOXP3的抑癌作用[19]。Won等[20]的研究顯示腫瘤細胞FOXP3的表達與胃癌患者良好預后相關，其途徑是通過增加腫瘤抑制蛋白p21的表達。這些腫瘤細胞中的信號分子可能也在免疫細胞中起作用，可能是FOXP3抑制腫瘤細胞生長的機制。

TIL是腫瘤組織中浸潤的T細胞、B細胞和NK細胞等一組異質性的細胞群。CD4+T細胞在多種腫瘤中被認為和預后良好相關，但在胃癌中其對患者預后的影響有不同結論，這取決于其亞型的功能[21]。本實驗結果顯示癌周FOXP3表達與腫瘤組織浸潤的CD4表達呈顯著正相關，同時研究顯示CD4陽性細胞和患者的生存期呈顯著正相關(P=0.004)；提示此研究條件下胃癌組織中CD4的表達可能為抑制腫瘤的效果，與FOXP3之間可能存在一定聯系。本實驗通過雙色免疫熒光實驗驗證了癌周表達的FOXP3與CD4的共表達情況，提示癌周FOXP3陽性細胞有較高比例CD4+/FOXP3+免疫細胞，但無法確認是否為Treg細胞。本實驗仍需進一步驗證CD4/FOXP3陽性細胞的細胞亞型。因此，胃癌組織中癌周的FOXP3+/CD4+仍不足以代表具有免疫抑制功能的Treg細胞。可能癌組織內不同部位的FOXP3+細胞具有不同的免疫表型甚至發揮不同的功能，對這類FOXP3+細胞的深入研究仍有較大的價值。

雖然癌巢內FOXP3的表達和患者的生存期無顯著相關性，但與癌周表達不同，FOXP3在癌巢的表達與腫瘤大小以及淋巴結轉移差異有統計學意義(P=0.02，P=0.043)；尤其與淋巴結的轉移差異有統計學意義，癌巢FOXP3高表達的病例中淋巴結轉移更少，提示臨床分期更低，這與Lee等[22]的研究結論相似。癌巢FOXP3陽性細胞中表達CD4更低，與癌周FOXP3陽性細胞有較大差異，進一步分析顯示FOXP3陽性細胞的不同亞群對FOXP3在腫瘤浸潤免疫細胞中的功能有重大意義。