胰腺癌中OPG表達及與預后的相關性

李明娜，王陸華，化宏金，張煒明，宋國新，平國強，張智弘

胰腺癌是病死率最高的消化系統惡性腫瘤，近年其發病率呈逐年上升及年輕化趨勢，在所有惡性腫瘤中病死率位于第4位[1]。其中胰腺導管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)占胰腺癌的80%以上。骨保護素(osteoprotegerin, OPG)是腫瘤壞死因子受體超家族的一員，與許多正常或腫瘤組織的細胞類型相互作用[2]。研究發現OPG是乳腺癌骨轉移、骨肉瘤和前列腺癌的腫瘤存活因子[3-5]，但在胰腺癌中的研究有限。KRAS突變是PDAC中最常見的突變基因，是胰腺癌發生的早期事件[6]，并控制胰腺疾病的發展[7]。本文采用免疫組化染色檢測OPG在PDAC組織中的表達，分析其與臨床病理特征、KRAS基因突變及預后的關系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2008年1月1日～2012年12月31日南京醫科大學第一附屬醫院行外科手術切除并經病理證實為PDAC標本102例，所有病理切片及組織蠟塊由兩名病理醫師同時閱片，每例均選取癌組織和癌旁組織各1塊。臨床資料包括患者年齡、性別、吸煙史、飲酒史、腫瘤大小、TNM分期、糖尿病史、總生存期等，所有病例術前均未行放、化療及其他治療。本實驗通過回顧電子病歷、臨床數據及隨訪時間更新至2016年6月。

1.2 組織芯片及免疫組化染色標本均經10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，制作組織芯片。納入本實驗標本102對(均為癌組織及癌旁組織)。組織芯片制作使用美國Beecher組織芯片陣列儀，選擇1.5 mm孔徑。組織芯片圖譜與各樣本的臨床病理特征相對應。組織芯片4 μm厚，免疫組化染色采用EnVision法。一抗OPG抗體購自Abcam公司，稀釋比為1 ∶800。

1.3 結果判讀免疫組化結果判讀由兩名病理醫師采用雙盲法獨立完成。OPG免疫組化染色陽性呈棕黃色，定位于細胞質。(1)按染色強度評分：無陽性著色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；(2)按陽性細胞百分比評分：陽性細胞數<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分。最后將兩項評分結果相乘，OPG染色>1.5分即定義為OPG高表達，相反則為OPG低表達(按總生存期對腫瘤組織OPG表達進行ROC曲線分析，顯示OPG最佳閾值為1.5)(圖1)。

1.4 KRAS基因檢測采用廈門艾德公司的試劑盒，運用ABI7500熒光定量PCR儀，對其中46例腫瘤組織KRAS基因第12、13號外顯子突變情況進行檢測，實驗操作按試劑盒說明書進行。

圖1 OPG的ROC曲線預測腫瘤特異性存活期(OPG最佳閾值為1.5)

1.5 統計學分析采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。腫瘤組織OPG表達、KRAS突變與臨床病理特征比較采用Person和Spearman相關性分析；死亡組和生存組一般資料比較采用χ2檢驗和Fisher精確檢驗；ROC曲線用于預測OPG高表達的閾值；單因素生存分析和多因素生存分析采用Cox回歸分析和Kaplan-Meier函數。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床特征102例PDAC分為死亡組和生存組，死亡組78例，生存組24例；男性62例，女性40例；年齡32～82歲；臨床分期ⅠA期3例，ⅠB期7例，ⅡA期39例，ⅡB期40例，Ⅲ期12例，Ⅳ期1例；術后化療30例。

2.2 死亡組和生存組比較死亡組中術后化療占24.4%，生存組中占45.8%。死亡組中腫瘤組織OPG高表達占85.9%，而生存組中腫瘤組織OPG高表達占25%，死亡組腫瘤組織OPG高表達遠高于生存組。腫瘤分化差(P=0.001)、腸系膜上靜脈受侵犯(P=0.006)、術后未化療(P=0.043)和OPG高表達(P<0.001)是影響PDAC預后的因素(表1)。

2.3 PDAC及癌旁組織中OPG的表達PDAC中OPG高表達率和低表達率分別為71.6%和28.4%；而癌旁組織中OPG高表達率和低表達率分別為51.0%和49.0%。OPG表達在PDAC和癌旁組織中的差異有顯著性(P<0.01，表2，圖2)。

表1 胰腺導管腺癌死亡組和生存組比較[n(%)]

表2 胰腺導管腺癌與癌旁組織中OPG的表達[n(%)]

2.4 PDAC中OPG表達與臨床病理特征的關系腫瘤組織OPG表達與腫瘤分化程度、腸系膜上動脈受侵犯、腸系膜上靜脈侵犯、門靜脈、術后化療均無相關性(P>0.05，表3)。

2.5 PDAC中KRAS突變與臨床特征的相關性46例PDAC進行KRAS突變檢測，其中24例野生型(52.2%)，22例突變型(47.8%)，包括KRAS外顯子2(G12D/S)突變10例，KRAS外顯子2(G12V/A/R/C/G13C)突變12例。相關性分析顯示KRAS突變只與糖尿病有關(P=0.025)，與OPG表達及其他臨床病理特征無相關性(P>0.05，表4)。

2.6 Cox單因素和多因素生存分析患者總生存期為1～72個月，中位總生存期為13.25個月，死亡78例，生存24例。Cox單因素生存回歸分析顯示：腫瘤大小(P=0.008)、分化程度(P<0.001)、腸系膜上動脈受侵犯(P=0.043)、腸系膜上靜脈受侵犯(P=0.004)、門靜脈受侵犯(P=0.033)、術后化療(P=0.023)、OPG表達(P<0.001)與PDAC患者預后顯著相關。將腫瘤分化程度、術后化療、OPG納入Cox多因素生存分析結果顯示：OPG是PDAC患者總生存期的獨立預后因素(P<0.001)。使用Kaplan-Meier生存曲線進一步分析OPG表達的預后意義，結果顯示OPG高表達患者的生存期遠低于低表達患者(P<0.01，圖3)。

ABCD

表3 胰腺導管腺癌中OPG表達與臨床病理特征的關系[n(%)]

表4 胰腺導管腺癌中KRAS突變與臨床病理特征的相關性[n(%)]

圖3 Kaplan-Meier生存曲線顯示OPG表達對胰腺導管腺癌患者總生存期的影響

2.7 PDAC中KRAS突變與預后的相關性PDAC組中KRAS野生型與較差預后相關(P=0.013)。進一步分析顯示：46例患者中術后化療10例(10/46)，其中KRAS野生型6例(6/10)，突變型4例(4/10)；術后未化療合計36例，其中KRAS野生型和突變型各18例。使用Kaplan-Meier生存曲線分析KRAS突變的預后意義，結果顯示KRAS突變型患者中位生存期為15個月，野生型患者中位生存期為11個月，突變型患者的生存期高于野生型患者(P=0.013，圖4)。

圖4 KRAS野生型和突變型的胰腺導管腺癌患者生存曲線

3 討論

胰腺癌是惡性程度高、預后差的消化系統腫瘤。目前，針對胰腺癌是以手術治療為主，結合放、化療等綜合治療。近年許多研究發現OPG可以作為TNF相關凋亡誘導配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)的可溶性誘騙性受體，與TRAIL結合，使腫瘤細胞逃逸TRAIL所誘導的凋亡，達到抗凋亡和促增殖的作用[3]。明確OPG在胰腺癌中的表達及與其他因素的相關性為治療提供新方向。

文獻報道OPG在胰腺正常組織和癌組織中均可表達，但在癌組織中表達更高[8]。本組對102例PDAC的OPG表達進行分析，PDAC組織中OPG高表達和低表達分別為71.6%和28.4%；而胰腺癌旁正常組織中OPG高表達及低表達分別占51.0%和49.0%，與文獻報道相符。其他腫瘤中OPG也有類似報道，如乳腺癌中表達率為45.9%[9]，肺非小細胞肺癌中陽性率為82.7%[10]。這些結果表明OPG在腫瘤組織表達更高，這可能與OPG在腫瘤組織中所介導的機制有關，上調OPG表達水平造成受體分布異常和表達異常，OPG與死亡受體競爭性結合TRAIL而降低TRAIL促凋亡的活性，從而使腫瘤細胞逃逸TRAIL所誘導的凋亡[3]。

本組還發現在PDAC組織中OPG表達與腫瘤分化程度、臨床分期、腸系膜上動脈和腸系膜上靜脈受侵犯、術后化療以及癌旁組織OPG表達均無相關性(P>0.05)。但有文獻報道胰腺癌中OPG高表達除與胰腺癌相關新發糖尿病相關，與其他臨床病理學特征均無相關性[8]。本實驗發現OPG高表達與糖尿病無關，研究結果差異原因：(1)樣本中糖尿病例數少(22例)；(2)22例糖尿病患者病史長達半年至數十年；(3)患者的發病時長無法判斷是否為新發糖尿病。與PDAC相比，其他惡性腫瘤中OPG表達有不同的結果，胃癌組織中OPG高表達與深部侵襲、淋巴結轉移、晚期和預后差密切相關[11]。非小細胞肺癌中OPG高表達與臨床T分期、淋巴結轉移和遠處轉移相關[10]。浸潤性乳腺癌中OPG陽性與腫瘤大小、陰性淋巴結數和Ki-67低增殖指數有關[9]。結直腸癌中OPG表達與腫瘤復發和遠處轉移相關[12]。研究結果差異原因：(1)樣本的選擇及樣本量的差異；(2)對于OPG的表達及陽性界定無明確標準，無明確的閾值[13-14]；(3)不同腫瘤的異質性不同。

OPG的預后意義已經在各惡性腫瘤中得到證實，OPG高表達與較差預后相關，OPG水平可以作為腫瘤進展的標志物或作為預后指標[10-12,15]。Shi等[8]研究發現OPG過表達提示胰腺癌預后不良，并且可以作為獨立的預后因素，本實驗與其結果相符。

關于OPG在腫瘤治療中所起的作用，臨床研究重組OPG在與腫瘤相關的骨溶解中的治療潛力[2], OPG可能是轉移性乳腺癌和多發性骨髓瘤中骨溶解的治療選擇[16]。因此，作者猜想靶向抑制OPG與TRAIL的結合可能是治療胰腺癌的方法。然而，包括PDAC在內的幾種腫瘤細胞顯示了抗TRAIL誘導的細胞凋亡。有研究報道突變的KRASG12D降低TRAIL誘導的PDAC細胞凋亡的敏感性，但是KRASG12D促進TRAIL抗性的機制尚不清楚。Kanzaki等[17]報道PDAC中OPG表達與TRAIL誘導的凋亡敏感性相關，沉默OPG使細胞對TRAIL誘導的凋亡敏感。同時發現OPG生成水平與KRAS突變狀態呈正相關，沉默KRAS可以在胰腺癌細胞中降低OPG水平，增加對TRAIL誘導細胞凋亡的敏感性。本組分析OPG表達與KRAS基因突變的相關性，并未發現兩者顯著相關。但需要說明的是，本實驗樣本并非胰腺癌細胞系，并非所有納入本組病例均進行KRAS檢測，故所得出的結論可能存在一定的偏倚。因此，OPG與KRAS基因突變的關系需要更多的數據來支持。

綜上所述，本實驗認為PDAC中OPG高表達提示較差的預后，是總生存期的獨立預后因素。OPG可能作為PDAC的一種新型預后生物學標志物，深入分析胰腺癌中OPG表達與KRAS基因突變有重要的臨床價值。