胃癌組織中CKS2蛋白表達與患者預后的相關性

劉 剛，杜 華，蘇秀蘭

胃癌是一種具有高度異質性的惡性腫瘤，其發病機制主要與遺傳物質改變、幽門螺桿菌及EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)感染及表觀遺傳學改變相關[1-3]。目前，手術切除后輔以化療是胃癌患者常規治療手段之一，一系列化療藥物和分子靶向藥物，如奧沙利鉑、5-氟尿嘧啶及赫賽汀等[4-6]提高胃癌患者的臨床治療效果，但由于其普遍存在藥物毒/副作用，胃癌患者的預后水平仍不容樂觀[7]。因此，有必要尋找新的胃癌分子治療靶點并探討其與胃癌預后的相關性，進一步優化胃癌患者的精準治療。

CKS是周期蛋白依賴性激酶亞家族的成員之一，定位于人染色體9q22.2的CKS2基因的表達水平與多種癌癥的發生、發展密切相關[8-13]。在癌癥發生過程中，CKS2可以調節CDK1-Cyclin B復合體的活性，從而參與細胞周期的調控以及腫瘤侵襲、轉移、凋亡等多個過程[14]，但該蛋白與胃癌患者的預后關系仍有待進一步分析。本文擬通過觀察CKS2蛋白在胃癌組織中的表達，探討其與胃癌臨床病理特征及預后的相關性，綜合生物信息學的分析結果，明確CKS2作為胃癌患者獨立的預后因素和分子治療靶點的潛能。

1 材料與方法

1.1 材料收集2013～2014年內蒙古醫科大學附屬醫院病理科存檔的203例胃癌石蠟標本及其相對應的癌旁組織標本，其中男性138例，女性65例；年齡32～80歲；管狀腺癌122例，乳頭狀腺癌16例，低黏附性腺癌53例，黏液腺癌12例；Lauren分型：腸型腺癌38例，彌漫型腺癌108例，混合型腺癌57例；根據第7版AJCC胃癌TNM分期標準對胃癌標本進行TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期者63例，Ⅲ+Ⅳ期者140例。另隨機收集內蒙古醫科大學附屬醫院病理科存檔的新鮮胃癌組織及對應的癌旁組織標本各30例；本實驗所有納入的胃癌患者，術前均未行任何放、化療或免疫治療，均有完整的臨床資料及隨訪資料。

1.2 試劑Trizol、qRT-PCR等分子類試劑均購自大連Takara公司；CKS2抗體購自武漢Proteintech公司；二抗及DAB顯色液購自北京中杉金橋公司。

1.3 方法

1.3.1qRT-PCR 分別取100 mg液氮中保存的胃癌組織及其對應的癌旁組織，利用Trizol法分別提取其RNA，并利用全波長酶標儀測定其濃度。按照逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA，放入-80 ℃冰箱中保存備用。按照SYBRGreen試劑盒說明書，在Pikoreal儀中進行后續的qRT-PCR分析。CKS2基因引物序列如下：上游5′-TTCGACGAACA CTACGAGTACC-3′，下游5′-GGACACCAAGTCTCCT CCAC-3′，內參GAPDH基因引物序列如下：上游5′-TGAACGGGAAGCTCACTG-3′，下游5′-GCTTCACCA CCTTCTTGATG-3′。反應條件如下：95 ℃ 10 min、95 ℃ 2 min、60 ℃ 20 min、70 ℃ 10 s，合計40個循環，反應完成后分析熔解曲線，每個組織樣本設置3個復孔，按2-ΔΔCt法計算基因表達水平。

1.3.2免疫組化 將收集的病理組織標本4 μm厚切片，常規脫蠟至水，利用pH 9.0的EDTA高壓鍋修復，自然冷卻后行免疫組化EnVision法染色，采用陽性切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 結果判斷免疫組化染色結果分析由兩位高年資病理醫師采用雙盲法閱片。在顯微鏡高倍鏡下(400×)隨機選擇4個視野，分別計數視野內的100個細胞，記錄抗體染色強度及陽性細胞百分比。按陽性細胞染色強度計分：無著色為0分，黃色為1分，淺棕色為2分，棕褐色為3分；按陽性細胞百分比計分：1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分；兩者相乘結果作為CKS2蛋白染色的最終評分，即≤6分為無或低表達，>7分為高表達。

1.5 統計學方法利用GEPIA數據庫綜合分析不同癌癥組織中的CKS2蛋白表達水平；通過UALCAN數據庫挖掘CKS2蛋白表達水平與胃癌臨床病理特征的相關性；采用GEPIA數據庫對比胃癌組織中CKS2蛋白表達水平與CCNB1、CCNA2及CDK1蛋白表達的相關性。所有數據均采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析；新鮮胃癌組織及癌旁組織中CKS2 基因的表達水平采用Wilcoxon signed-rink非參數檢驗進行分析；CKS2蛋白表達水平與臨床病理特征的相關性則采用Pearson χ2進行分析；采用Kaplan-Meier和Log-rank分析患者生存曲線；采用多因素Cox比例風險回歸模型對有統計學意義的各臨床病理參數的關系進行分析說明；以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌組織中CKS2基因的表達采用qRT-PCR法檢測新鮮胃癌組織及其對應癌旁組織中CKS2基因的表達水平，實驗結果表明胃癌組織中CKS2基因的表達水平(0.97±0.16)高于癌旁組織(0.38±0.11，P<0.05，圖1)。

2.2 胃癌中CKS2蛋白表達與臨床病理特征的相關性在胃癌組織中CKS2蛋白高表達(121/203，59.60%)于細胞核中，而癌旁組織中CKS2蛋白呈低表達(82/203，40.40%)(圖2)。在胃癌組織中，CKS2蛋白表達與淋巴結轉移(χ2=8.822，P=0.003)、腫瘤浸潤程度(χ2=6.991，P=0.008)、Lauren分型(χ2=18.363，P<0.001)及TNM分期(χ2=7.990，P=0.005)相關；與患者性別、年齡、HER-2表達、MSI狀態、EBV感染以及組織學類型無相關性(P>0.05，表1)。

圖1 胃癌及癌旁組織中CKS2基因表達水平：與癌旁組相比，*P<0.05

ABCD

2.3 胃癌患者預后的生存分析進一步利用單因素Cox風險回歸模型分析胃癌患者的預后水平，實驗結果表明，CKS2蛋白表達水平(P=0.002)、腫瘤浸潤深度(P=0.012)、淋巴結轉移(P<0.001)以及TNM分期(P<0.001)與胃癌患者的不良預后相關(表2)。采用多變量Cox風險回歸模型分析胃癌患者的預后水平，分析結果顯示CKS2蛋白表達水平(P=0.015)以及TNM分期(P=0.001)是胃癌患者5年總生存率低的獨立危險因素。Kaplan-Meier生存曲線結果顯示，胃癌中CKS2蛋白高表達患者的5年生存率低于低或無CKS2蛋白表達患者(P<0.05)；與TNM分期Ⅰ+Ⅱ期患者相比，Ⅲ+Ⅳ期患者的5年生存率降低(P<0.05，圖3)。

表1 胃癌中CKS2蛋白表達與臨床病理特征的關系[n(%)]

2.4 生物信息學分析GEPIA數據庫分析結果顯示，在腎上腺皮質癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺浸潤癌、子宮頸鱗癌、結腸腺癌、彌漫大B細胞淋巴瘤、食管癌、多形性膠質母細胞瘤以及頭頸鱗癌等腫瘤組織中，CKS2蛋白表達水平均高于其對應正常組織(P<0.05，圖4)。

UALCAN數據庫結果顯示，在胃癌組織中CKS2蛋白表達水平高于癌旁組織(P<0.05)，其表達水平與腫瘤分期及幽門螺桿菌感染無關(P>0.05，圖5)。數據庫的分析結果亦表明女性胃癌患者腫瘤組織中CKS2蛋白表達水平高于男性患者(P<0.05)；不同年齡胃癌患者的腫瘤組織中CKS2蛋白表達水平差異無顯著性(P>0.05)，年輕胃癌患者(21～40歲)腫瘤組織中CKS2蛋白表達水平與癌旁組織中的表達水平差異無顯著性(P>0.05)。

表2 胃腺癌患者預后因素的Cox風險回歸模型分析

圖3 胃癌患者的5年生存曲線分析：A.CKS2表達水平與胃癌患者5年生存率的相關性分析；B.TNM分期與胃癌患者5年生存率的相關性分析

圖4 GEPIA數據庫中CKS2蛋白表達水平：癌為癌組織；正為癌旁正常組織

圖5 胃癌組織(TCGA樣本)中CKS2表達與臨床病理特征的相關性：A.CKS2表達與胃癌發生的相關性，與正常組比較，*P<0.05；B.CKS2表達與胃癌分期的相關性，與正常組比較，*P<0.05；C.CKS2表達與胃癌患者性別的相關性，與正常組比較，*P<0.05；D.CKS2表達與胃癌患者年齡的相關性，與正常組比較，*P<0.05；與21～40歲組比較，#P<0.05；E.CKS2表達與胃癌腫瘤分級的相關性，與正常組比較，*P<0.05；與1級組比較，#P<0.05；F.CKS2表達與幽門螺旋菌感染的相關性；與正常組比較，*P<0.05

GEPIA數據庫分析結果顯示，胃癌組織中的CKS2蛋白表達水平與CCNB1、CCNA2以及CDK1蛋白表達水平相關。進一步的實驗結果表明CKS2可能參與胃癌發生、發展中細胞周期調控過程(圖6)。

圖6 胃癌組織中CKS2蛋白與CCNB1(A)、CCNA2(B)及CDK1(C)蛋白表達水平的相關性

3 討論

在哺乳動物中，細胞周期蛋白激酶亞單位家族有2個成員，即CKS1和CKS2，均由79個氨基酸組成，其蛋白序列具有81%的同源性。該基因家族由Richardson等[15]于1990年首次克隆，進一步證明人CKS1位于第8q21號染色體，而CKS2基因位于第9q22號染色體。研究表明，CKS1和CKS2均參與細胞增殖的調控，作為SCFSkp2介導p27泛素化降解過程的所需成分，CKS1主要參與調控細胞周期G1/S轉換，而CKS2對細胞周期G2/M的轉換至關重要[16-17]。

CKS家族成員與癌癥發生過程密切相關，在乳腺癌、肺癌、結直腸癌、前列腺癌和腎癌等多種腫瘤組織中CKS1蛋白表達水平增加，與患者的不良預后密切相關[18]，且在結直腸癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌和肝癌等多種腫瘤組織中CKS2蛋白表達水平增加[19]，與本組GEPIA數據庫分析結果一致。

為了證實CKS2表達水平與胃癌發生的相關性，本組實驗檢測了CKS2基因在胃癌組織中的表達水平高于癌旁組織，與文獻報道[20]結果一致。為了進一步驗證CKS2表達水平與胃癌患者預后的相關性，本組擴大了納入的胃癌病例數，并利用免疫組化染色進一步證實胃癌組織中CKS2蛋白表達水平與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、Lauren分型以及TNM分期密切相關。分析胃癌患者的預后，實驗結果表明CKS2蛋白高表達水平的胃癌患者5年生存時間低于CKS2蛋白低表達或不表達的胃癌患者，最終證實CKS2蛋白過表達提示胃癌患者的死亡風險較高。

雖然本組免疫組化染色結果表明胃癌組織中CKS2蛋白表達水平與患者年齡、性別無關，但UALCAN數據庫分析結果顯示，胃癌組織中CKS2蛋白表達水平與患者性別密切相關，因此需要進一步擴大樣本范圍以明確CKS2蛋白表達水平與胃癌患者臨床病理的相關性，本組生物信息學結果表明在胃癌組織中，CKS2蛋白表達水平與CCNB1、CCNA2及CDK1蛋白表達密切相關，但CKS2蛋白與胃癌細胞增殖、細胞周期轉換之間的調控機制尚待進一步分析，未來的研究應進一步明確上述潛在的調控機制，以確定CKS2蛋白在胃癌治療中的靶向應用。