缺氧誘導(dǎo)因子-1α上調(diào)Cx43表達造成星形膠質(zhì)細胞損傷的作用機制研究

官俏兵 張曉玲 沈和平 俞曉翔 阮水良

近年來，星形膠質(zhì)細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用得到了較多的研究[1]。在缺血缺氧性腦病的研究中發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細胞可以通過自身炎癥反應(yīng)釋放大量炎癥因子，造成神經(jīng)細胞損傷[2-3]。缺血缺氧條件下，縫隙連接蛋白（Cx43）的表達增加，且空間分布發(fā)生改變，從而調(diào)控細胞通道蛋白表達，介導(dǎo)物質(zhì)交換。Cx43還可以通過增加星形膠質(zhì)細胞半通道的開放、減少全通道的活性來增加神經(jīng)細胞的敏感性，促進細胞死亡的發(fā)生[4-5]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1 alpha，HIF-1α）可以促進凋亡蛋白B細胞淋巴瘤/白血病-2基因相關(guān)X蛋白（B-cell lymphoma-2 associated X，BAX）的表達，B細胞淋巴瘤/白血病-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）蛋白下調(diào)，而HIF-1α敲除后可以明顯抑制缺血缺氧性腦損傷[6-7]。也有研究表明，HIF-1α的高表達可以促進血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的表達，激活血管內(nèi)皮細胞生長因子受體2通路，促進腦血管的新生[8]。鑒于Cx43在缺血缺氧性腦病中的重要作用，本研究對糖氧剝奪（oxygen glucose deprivation，OGD）條件下，HIF-1α 上調(diào)Cx43表達造成星形膠質(zhì)細胞損傷的作用機制進行了進一步探討。

1 材料和方法

1.1 主要材料 人星形膠質(zhì)細胞HA細胞株（實驗室自備）；HEK293T細胞（武漢普諾賽生命科技有限公司，批號：CL0005）；大腸桿菌感受態(tài)細胞 DH5α（北京天根生化科技有限公司，批號：CB10101）；慢病毒載體GV218、陰性對照慢病毒（上海吉凱公司，批號：K857435）；RT-qPCR試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：18573364）；質(zhì)粒抽提試劑盒（美國Promega公司，批號：194754）；DMEM、Opti-MDM 培養(yǎng)基（美國 Invitrogen公司）；Lipofectamine 2000（美國 Invitrogen公司）；HIF-1α和Cx43的引物（上海生工生物工程公司合成）；HIF-1α 的小干擾 RNA（siRNA）及對照（蘇州吉瑪公司）；CCK-8試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：C0038）；Annexin-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（美國BD公司，批號：556547）；TUNEL染色試劑盒（美國Roche公司，批號：11767305001）；谷氨酸水平檢測試劑盒（美國 Biovision公司，批號：629100）；TNF-α、IL-6的ELISA檢測試劑盒（上海酶聯(lián)生物有限公司，批號：1077385、1058097）；Bcl-2、B 細胞淋巴瘤/白血病-2 基因相關(guān)啟動子（Bad）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、細胞色素 C（Cyt-C）、Cx43、HIF-1α 的單克隆抗體（美國Cell Signaling Technology 公司，批號：15071、189208、966208、11940、3512、36169）；蛋白提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：1800125）。

1.2 過表達HIF-1α的HA細胞系的構(gòu)建 將制備的質(zhì)粒20 μg與Opti-MEM培養(yǎng)基混合，用Lipfeceamine 2000轉(zhuǎn)染至HEK293T細胞（用于質(zhì)粒的擴增和提取）。培養(yǎng)12 h后，棄去培養(yǎng)基，更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集上清液后用0.45 μm的濾膜過濾，離心后得到擴增后的質(zhì)粒濃縮液。HA細胞生長至對數(shù)期，將質(zhì)粒濃縮液稀釋后與HA共培養(yǎng)，進行質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染，24 h后吸去培養(yǎng)基，更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。同時設(shè)置陰性對照組。將過表達HIF-1α的HA細胞定為HIF-1αlent組，而陰性組為NC-lent組，未經(jīng)過處理的HA細胞為Con組。

1.3 siRNA沉默HA細胞中HIF-1α基因的表達 取對數(shù)期的細胞進行轉(zhuǎn)染，將細胞接種于6孔板內(nèi)，待細胞長至80%左右進行轉(zhuǎn)染。設(shè)置對照組（Con，未經(jīng)過處理的HA細胞）、siRNA陰性對照組（siRNA-NC）和siRNA-HIF-1α組。將siRNA-HIF-1α溶解于Opti-MEM培養(yǎng)基中，室溫孵育5 min，另外取Lipofectamin 2000溶解于Opti-MEM培養(yǎng)基中，室溫孵育5 min，混合2種Opti-MEM液，孵育5 min后加入HA細胞中，室溫孵育6 h后更換為正常的完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。48 h后進行轉(zhuǎn)染效率的檢測。

1.4 HIF-1α、Cx43 mRNA表達水平檢測 采用RT-qPCR法。將細胞接種至6孔板中，分組后置于OGD條件下（將細胞置于缺氧罐中模擬OGD環(huán)境）培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)完成后細胞刮刮下細胞并收集。Trizol試劑裂解細胞后提取總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，設(shè)置GAPDH為內(nèi)參，GAPDH上游引物:5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′；HIF-1α 上游引物 ：5′-CAAAACACACAGCGAAGC-3′，下游引物：5′-TCAACCCAGCATATCCACC-3′；Cx43 上游引物 ：5′-TCACTGGGGTGACTTCACTACTTT-3′，下游引物：5′-AGGCTGACTCAACCGCTGTC-3′。逆轉(zhuǎn)錄合成的反應(yīng)條件為 70 ℃ 5 min，0 ℃ 5 min，37 ℃ 5 min，42 ℃ 60 min，70℃ 10 min，-20℃保存。PCR的反應(yīng)體系為20 μl，其中 SYBR Premix Ex Taq 10 μl、cDNA 2 μl、上下游引物各 0.4 μl、CEPC 水 7.2 μl。PCR 擴增反應(yīng)條件為:94 ℃5 min預(yù)變性，94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共 30個循環(huán)，72 ℃延伸 10 min。采用 2-ΔΔCt相對定量法，以GAPDH為內(nèi)參，分析mRNA的相對表達水平。

1.5 HIF-1α、Cx43、細胞凋亡相關(guān)蛋白 Bad、Caspase-3、Cyt-C、Bcl-2蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。將細胞接種至6孔板中，分組后置于OGD條件下培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)完成后細胞刮刮下細胞并收集。PBS洗2次后，在冰上加入NP-40裂解液100 μl裂解30 min，同時不定時震蕩，保證裂解液的充分接觸。3 000 r/min離心15 min，收集上清液后BCA試劑盒進行蛋白濃度的定量并調(diào)整蛋白濃度，電泳，轉(zhuǎn)膜，PVDF膜使用5%脫脂奶粉封閉2 h，用TBST稀釋一抗（單克隆抗體），4℃一抗過夜孵育，次日取出PVDF膜后用TBST洗2次后，用辣根過氧化物酶標記的二抗在37℃孵育4 h。孵育完成后用化學(xué)發(fā)光法檢測，采用Image Pro-Plus 6.0軟件進行灰度值的分析，以GAPDH為內(nèi)參，結(jié)果以目的蛋白光密度值與內(nèi)參蛋白光密度值之比表示。

1.6 細胞活力檢測 采用CCK-8法。OGD條件下培養(yǎng)3、6、9、12、15、18、21、24 h 后，加入 10 μl的 CCK-8 試劑，在常規(guī)培養(yǎng)條件下繼續(xù)孵育4 h，同時設(shè)置空白對照。孵育完成后在480 nm處檢測吸光度（OD）值。細胞活力=[（OD實驗組-OD背景）/（OD對照組-OD背景）]×100%。

1.7 細胞凋亡率檢測 將細胞接種到6孔板中，OGD條件下培養(yǎng)24 h，收集細胞后加入Binding Buffer重懸。而后加入Annexin V-FITC液10 μl混勻避光反應(yīng)10 min，再加入10 μl的PI染色避光反應(yīng)10 min，PBS洗去多余染色液后，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.8 谷氨酸水平檢測 將細胞接種至6孔板中，分組后置于OGD條件下培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)完成后細胞刮刮下細胞并收集。按照細胞個數(shù)1 000∶2的比例加入試劑（1 000個細胞加入2 μl），破碎細胞后常溫下離心，取上清液。采用分光光度法檢測570 nm處的OD值，然后根據(jù)標準曲線測定谷氨酸水平。谷氨酸水平以mg/L表示。

1.9 培養(yǎng)基中炎癥因子NO、TNF-α、IL-6表達水平檢測 采用ELISA法。將細胞接種至6孔板中，分組后置于OGD條件下培養(yǎng)24 h。取細胞培養(yǎng)基后離心，得到上清液，按照ELISA試劑盒說明書進行操作。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HIF-1α對于OGD條件下Cx43表達的影響 慢病毒過表達HIF-1α后，相比Con組和NC-lent組，HIF-1α-lent組HIF-1α及Cx43 mRNA和蛋白表達水平在OGD條件下均上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。而siRNA沉默HIF-1α后，相比Con組和siRNA-NC組，siRNA-HIF-1α組 HIF-1α 及 Cx43 mRNA和蛋白表達水平在OGD條件下均下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均 P＜0.05），見圖 1。

2.2 HIF-1α對于OGD條件下HA細胞活力的影響慢病毒過表達HIF-1α后，不同時間點Con組和NC-lent組細胞活力比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；而相比Con組和NC-lent組，HIF-1α-lent組細胞活力下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），siRNA沉默HIF-1α 后，OGD 條件下處理 3、6、9、12、15、18、21、24 h，不同時間點Con組和siRNA-NC組細胞活力比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；而相比Con組和siRNA-NC組，siRNA-HIF-1α組細胞活力升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均 P＜0.05），見圖 2。

2.3 HIF-1α對于OGD條件下HA細胞凋亡率的影響慢病毒過表達HIF-1α后，Con組、NC-lent組和HIF-1α-lent組細胞凋亡率分別為（32.35±3.15）%、（37.32±4.15）%和（63.54±5.12）%。相比 Con組和 NC-lent組，HIF-1α-lent組細胞凋亡率升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均 P＜0.05）。siRNA 沉默 HIF-1α后，Con組、siRNANC組和siRNA-HIF-1α組細胞凋亡率分別為（42.35±5.14）%、（40.24±4.12）%和（18.65±2.13）%。相比 Con 組和siRNA-NC組，siRNA-HIF-1α組細胞凋亡率下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖3。

圖1 缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）對于糖氧剝奪（OGD）條件下縫隙連接蛋白（Cx43）表達的影響[（a：HIF-1α對于OGD條件下HIF-1α和Cx43蛋白表達水平的電泳圖；b：HIF-1α和Cx43 mRNA表達水平結(jié)果；c：HIF-1α和Cx43蛋白表達水平結(jié)果；d：沉默HIF-1α后，HIF-1α和Cx43 mRNA表達水平結(jié)果；e：沉默HIF-1α后，HIF-1α和Cx43蛋白表達水平結(jié)果；與Con組比較，*P＜0.05；與 NC-lent組和小干擾 RNA（siRNA）-NC 組比較，△P＜0.05]

圖2 缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）對于糖氧剝奪條件（OGD）條件下HA細胞活力的影響[a：HIF-1α過表達后，細胞活力改變的結(jié)果；b：沉默HIF-1α后，細胞活力改變的結(jié)果；與Con組比較，*P＜0.05；與小干擾RNA（siRNA）-NC組和NC-lent組比較，△P＜0.05]

圖3 缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）對于糖氧剝奪（OGD）條件下HA細胞凋亡率的影響（siRNA為小干擾RNA）

2.4 HIF-1α對于OGD條件下HA細胞谷氨酸水平的影響 慢病毒過表達HIF-1α后，Con組和NC-lent組細胞中谷氨酸水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；而相比Con組和NC-lent組，HIF-1α-lent組細胞中谷氨酸水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。siRNA沉默HIF-1α后，Con組和siRNA-NC組細胞中谷氨酸水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；而相比Con組和siRNA-NC組，siRNA-HIF-1α組細胞中谷氨酸水平下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖4。

圖4 缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）對于糖氧剝奪（OGD）條件下HA細胞谷氨酸水平的影響[與Con組比較，*P＜0.05；與NC-lent組和小干擾 RNA（siRNA）-NC 組比較，△P＜0.05]

2.5 HIF-1α對于OGD條件下HA細胞培養(yǎng)基中NO、TNF-α、IL-6表達的影響 慢病毒過表達HIF-1α后，Con組和 NC-lent組細胞中NO、TNF-α、IL-6表達水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；而相比Con組和NC-lent組，HIF-1α-lent組細胞培養(yǎng)基中NO、TNF-α、IL-6表達水平均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。siRNA沉默HIF-1α后，Con組和siRNA-NC組細胞培養(yǎng)基中NO、TNF-α、IL-6表達水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；而相比Con組和siRNANC 組，siRNA-HIF-1α 組細胞培養(yǎng)基中 NO、TNF-α、IL-6表達水平均下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖5。

2.6 HIF-1α對于OGD條件下HA細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響 慢病毒過表達HIF-1α后，Con組和NC-lent組細胞凋亡相關(guān)蛋白表達水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；而相比Con組和NC-lent組，HIF-1αlent組中Bad、Caspase-3、Cyt-C蛋白表達水平均上調(diào)，而Bcl-2蛋白表達水平下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。siRNA沉默HIF-1α后，Con組和siRNA-NC組細胞凋亡相關(guān)蛋白表達水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；而相比Con組和siRNA-NC組，siRNA-HIF-1α組中Bad、Caspase-3、Cyt-C蛋白表達水平均下調(diào)，而Bcl-2蛋白表達水平上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖 6。

3 討論

圖5 缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）對于糖氧剝奪（OGD）條件下培養(yǎng)基中炎癥因子NO、TNF-α、IL-6表達的影響[a：HIF-1α過表達后，NO、TNF-α、IL-6 的表達水平；b：沉默 HIF-1α 后，NO、TNF-α、IL-6 的表達水平；與 Con 組比較，*P＜0.05；與 NC-lent組和小干擾RNA（siRNA）-NC 組比較，△P＜0.05]

圖6 缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）對于糖氧剝奪（OGD）條件下HA細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響 [a：HIF-1α對于OGD條件下HA細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的電泳圖；b：HIF-1α過表達后，蛋白的相對表達水平；c：HIF-1α沉默后，蛋白的相對表達水平；Bad為B細胞淋巴瘤/白血病-2基因相關(guān)啟動子；Caspase-3為半脫氨酸蛋白酶-3；Cyt-C為細胞色素C；Bcl-2為B細胞淋巴瘤/白血病-2基因相關(guān)X蛋白；與Con組比較，*P＜0.05；與NC-lent組和小干擾RNA（siRNA）-NC 組比較，△P＜0.05]

HIF-1是一個在缺血缺氧狀態(tài)下調(diào)節(jié)氧穩(wěn)態(tài)的轉(zhuǎn)錄因子，有異源二聚體α和β亞基組成，和促紅細胞生成素基因上的低氧反應(yīng)原件結(jié)合[9]。其中HIF-1α是較為重要的轉(zhuǎn)錄因子，在缺氧條件下，細胞內(nèi)的HIF-1α表達水平增高，轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)并且持續(xù)高表達，同時不受到氧濃度的影響[10]。在缺氧性腦病的研究中發(fā)現(xiàn)，腦損傷的發(fā)生和HIF-1α具有密切的關(guān)系，一方面，HIF-1α可以促進促紅細胞生成素及受體的表達，誘導(dǎo)腦紅蛋白和血管生長因子的表達，啟動應(yīng)激反應(yīng)[11]；另一方面可以調(diào)控細胞定向遷移、促進集體修復(fù)。可以說HIF-1α具有雙刃劍的作用，且與多種基因和信號的改變有關(guān)。凋亡是腦缺血缺氧后細胞死亡的一種方式。有研究表明HIF-1α可以調(diào)控細胞的凋亡[12-13]。在血管內(nèi)皮細胞的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，RNA干擾HIF-1α的表達后，在OGD條件下，細胞凋亡受到抑制[14]。而Williams等[15]研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α調(diào)控凋亡的作用和凋亡基因Bad、Bax依賴性有關(guān)。HIF-1α還可以通過負反饋調(diào)節(jié)細胞的凋亡，凋亡抑制基因Survivin是凋亡蛋白抑制基因家族成員，當(dāng)HIF-1α沉默后，缺氧條件下Survivin基因的表達受到HIF-1α的調(diào)控，且表達上調(diào)，同時抑制了缺血缺氧條件下神經(jīng)細胞的凋亡[16]。

Cx43是縫隙連接蛋白的一種，是細胞通訊的主要方式之一。缺血性損傷后，半通道由關(guān)閉轉(zhuǎn)向開放狀態(tài)，介導(dǎo)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運[17]。研究發(fā)現(xiàn)，缺血缺氧后，Cx43的表達顯著增高，尤其是磷酸化水平增高，且腦損傷的程度和Cx43的細胞內(nèi)轉(zhuǎn)位和表達水平增高呈正比[18]。Retamal等[19]研究發(fā)現(xiàn)，抗霉素A處理抑制Ast后，Cx43通道開放，同時細胞內(nèi)染料的攝取量增高。Kalvelyte等[20]研究發(fā)現(xiàn)，Cx43過表達后，可以加速Hela細胞的凋亡程度。Cx43在星形膠質(zhì)細胞中的表達水平最高，分布也最為廣泛。星形膠質(zhì)細胞作為神經(jīng)細胞的輔助性細胞，在缺血缺氧性腦損傷中具有廣泛的作用。當(dāng)Cx43表達增高后，可以介導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞的損傷，同時釋放炎癥因子，擴大損傷。但是目前Cx43的表達調(diào)控機制尚不清楚。

鑒于HIF-1α作為轉(zhuǎn)錄因子的重要作用，本實驗采用了過表達和siRNA沉默方法研究HIF-1α對于Cx43的調(diào)控作用。結(jié)果顯示，在HIF-1α過表達后，OGD條件下，Cx43的表達也增高，兩者呈正相關(guān)。同時星形膠質(zhì)細胞中炎癥因子的表達增高，細胞凋亡率增高。這提示，HIF-1α可以調(diào)控Cx43的表達，同時Cx43高表達后進一步促進了星形膠質(zhì)細胞的損傷。而siRNA沉默HIF-1α后，Cx43的水平也下調(diào)，抑制了星形膠質(zhì)細胞的損傷。因此，從過表達和基因沉默實驗結(jié)果來看，HIF-1α可以調(diào)控Cx43的表達，以此影響星形膠質(zhì)細胞的狀態(tài)。

綜上所述，本實驗發(fā)現(xiàn)HIF-1α可以通過調(diào)控Cx43的表達來影響缺血缺氧下星形膠質(zhì)細胞的損傷，這是HIF-1α在缺血缺氧性腦病損傷中的作用機制之一。