索拉非尼聯合貝伐單抗對小鼠宮頸癌細胞株U14移植瘤抑制作用的研究

吳林珍 魯建央 孫亞青 胡志英

子宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，居女性惡性腫瘤死亡的第2位[1]，在我國，更是居女性惡性腫瘤死亡的首位[2-3]。隨著對腫瘤細胞生長的分子調控機制的研究不斷深入，針對惡性腫瘤的分子靶向治療已經成為現代腫瘤學研究的熱點。索拉非尼作為一種多靶點激酶抑制劑，已被用于多種惡性腫瘤的治療；貝伐單抗作為單靶點藥物也已被應用于肺癌等的一線治療方案。本實驗通過建立615小鼠宮頸癌細胞株U14移植瘤動物模型，聯合使用索拉非尼和貝伐單抗后觀察宿主瘤體變化，檢測移植瘤組織中血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和 B 細胞淋巴瘤/白血病-2基因相關X蛋白（B-cell lymphoma-2 associated X，Bax）基因的表達，探討兩藥協同抗腫瘤的作用，旨在為這種新型生物化療模式的臨床應用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和儀器 宮頸癌細胞株U14（中國醫學院科學院）；615小鼠（上海西普爾-必凱實驗動物有限公司）；索拉菲尼片（德國拜耳公司，規格：0.2 g/片，批號：H20110599）；貝伐單抗注射液（上海自羅氏制藥有限公司，規格：100 mg/支，濃度 25 mg/ml，批號：S20100068）；生物安全柜（美國 Thermo公司，1300A2）；均質機（法國Bertin公司）；冷凍高速離心機（美國Thermo公司）；ABI StepOnePlus PCR儀（美國Bio-Rad公司）；超低溫冰箱（美國Thermo公司）；微量核酸測定儀（美國 Thermo公司，nanodrop）；PCR儀（美國 Bio-Rad公司）；制冰機（日本Panasonic公司，SIM-F140AY65-PC）；移液器（德國 Eppendorf公司，Research）；RNA 提取試劑盒（日本TaKaRa公司，AHF1991D）；RT反轉錄試劑盒（日本TaKaRa公司，RR036A）；SYBR Green熒光定量PCR染料（日本TaKaRa公司，AK9301）。本實驗依托浙江中醫藥大學動物實驗中心完成。

1.2 小鼠荷瘤模型的制備

1.2.1 小鼠宮頸癌細胞株U14復蘇 從液氮保存罐中取出裝有宮頸癌細胞株U14的凍存管，立即放入37℃水浴中，快速搖晃，直至凍存液完全融化。將細胞懸液移入離心管，緩慢放入4 ml RPMI1640培養液，離心，棄上清液，用RPMI1640培養液混懸沉淀細胞，調整細胞濃度為7.5×107/ml，用臺盼藍染色法檢測復蘇的細胞活性，放置培養箱中備用。

1.2.2 小鼠宮頸癌細胞株U14傳代 宮頸癌細胞株U14復蘇后，于無菌條件下按每只615小鼠腹腔內注射0.2 ml約1.5×107個活細胞。待7～10 d后，在無菌條件下抽取腹水用于傳代或荷瘤。

1.2.3 移植成瘤 將上述抽取的腹水，用0.9%氯化鈉溶液稀釋后取樣用臺盼藍染色鏡檢，證實為成活瘤細胞并計數，調整細胞濃度為5×107/ml。隨即依次在615小鼠右側腋下于腋中線上約 2 cm處皮下接種0.2 ml約1×107個活細胞。每日觀察小鼠及其局部成瘤情況，腫瘤直徑≥5 mm時為成瘤。

1.3 實驗分組 采用隨機數字表法將40只已成瘤小鼠分為空白對照組、索拉非尼組、貝伐單抗組和聯合用藥組4組，每組10只。索拉非尼組給予索拉非尼溶液4.5 ml/kg（索拉菲尼片200 mg/片溶解于30 ml 0.9%氯化鈉溶液，濃度調整至6.67 mg/ml），經小鼠胃管灌入，1次/d，共28 d；貝伐單抗組給予貝伐單抗10 ml/kg（貝伐單抗液濃度稀釋至0.5 mg/ml），小鼠左側腋部皮下注射，1次/d，連用28 d；聯合用藥組兩藥的劑量及用法分別同單藥組；空白對照組不做任何處理。

1.4 移植瘤體積和重量測定 用藥結束后第3天脫臼法處死小鼠，剝離瘤體，測量移植瘤體積（cm3），并用天平秤稱重量（g）。

1.5 4組腫瘤細胞VEGF和Bax mRNA表達水平檢測采用RT-PCR法。先進行組織的裂解：剪取瘤體組織到均質管中，加入 350 μl裂解 Buffer RL（已加入 50×DTT Solution），均質機上破碎裂解。分別收集4組腫瘤細胞，總RNA提取操作按照TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit說明書進行。再將提取的RNA置于RT反應液進行反轉錄反應，條件為37℃ 15 min，85℃5 s，獲得cDNA保存于-20°C冰箱備用。選用生工生物工程（上海）有限公司設計并合成的RT-PCR引物序列，PCR反應操作按照TaKaRa熒光定量試劑盒SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（Perfect Real Time）進行，將獲得的cDNA用RT-PCR儀進行擴增，引物序列見表1。擴增反應條件為：預變性 95°C 3 min；40個循環（95°C 10 s，60 °C 30 s）；溶解曲線：從 55 °C 開始，每 30 s升高0.5°C，直到95°C，循環1次。所有反應信息資料由ABI StepOnePlus PCR儀收集，Ct值通過計算機軟件來測量和計算，轉錄水平通過公式2-ΔΔCt計算。

表1 RT-PCR引物序列

1.6 統計學處理 采用SPSS 18.0統計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 藥物對小鼠移植瘤生長的影響 索拉菲尼組、貝伐單抗組移植瘤體積及重量均低于空白對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；索拉菲尼組、貝伐單抗組、空白對照組移植瘤體積及重量均高于聯合用藥組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表2。

表2 藥物對小鼠移植瘤生長的影響

2.2 4組腫瘤細胞VEGF和Bax mRNA表達水平比較索拉菲尼組、貝伐單抗組、聯合用藥組VEGF mRNA表達水平均低于空白對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；聯合用藥組VEGF mRNA表達水平均低于索拉菲尼組、貝伐單抗組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。聯合用藥組Bax mRNA表達水平均高于索拉菲尼組、貝伐單抗組、空白對照組，差異均有統計學意義（均 P＜0.05），見表 3、圖 1-2（插頁）。

表3 4組腫瘤細胞VEGF和Bax mRNA表達水平比較

3 討論

子宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅著婦女的健康和生命；子宮頸癌患病率居高不下，并有年輕化的趨勢，目前發病率僅次于乳腺癌，已成為臨床研究的熱點領域之一[4]。目前，手術和放化療是子宮頸癌的主要治療手段。對于早期患者，手術治療是較為有效的治療方法；對于中、晚期宮頸癌患者，常常因為失去手術機會，進而只能采用放化療治療手段。但是傳統化療藥物，無論是細胞周期特異性還是非特異性藥物，在殺傷腫瘤細胞的同時，也殺傷大量的非腫瘤性正常細胞，從而產生一系列毒副反應；放療則會產生一系列合并癥，包括放射線腸炎、放射線膀胱炎及陰道局部攣縮影響性生活等不良反應。因此尋找子宮頸癌更為有效的治療措施是非常必要的。具有生物靶向特性的藥物，在提高療效的同時減少毒副反應，是近年來國內外研究治療子宮頸癌尤其是中晚期子宮頸癌、復發性宮頸癌的熱點。

血管生成通常發生在發育或傷口愈合期間，當機體產生腫瘤時，血管系統可以通過向腫瘤細胞提供氧氣和營養物質從而促進腫瘤發展[5]。VEGF在腫瘤血管生成中起著非常重要的作用,它能夠直接促進血管內皮細胞分裂增殖、分化、增生,與腫瘤的生長、浸潤和轉移有密切關系[6-7]。國內外研究表明宮頸癌組織VEGF表達與淋巴管轉移呈正相關，新生淋巴管在腫瘤生長中提供腫瘤生長所需要的營養，加深腫瘤細胞的生物異質性[8-9]。由于VEGF的水平與血管形成及腫瘤生長密切相關，故VEGF可作為腫瘤患者的一個預后參考指標，并指導和監測臨床療效；同時也為應用血管生長抑制劑進行阻斷性治療腫瘤提供理論依據[10]。

索拉非尼在其化學特性上可以有力地抑制迅速加速纖維肉瘤（Raf-1）原癌基因絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶，并且有較強的激酶選擇特性，在體外索拉非尼還表現出對野生型及V599E突變B-Raf活性的抑制作用[11]。于此同時，在新生血管形成及腫瘤進展中，索拉非尼對多種酪氨酸激酶受體有明顯抑制作用，包括血管內皮生長因子受體（VEGFR）-2、VEGFR-3、血小板衍化生長因子受體、Fms樣酪氨酸激酶3（Flt-3）等。此外，索拉非尼抑制細胞周期蛋白及細胞周期相關蛋白，如細胞周期蛋白D1（CyclinD1）、細胞周期素依賴激酶4（cdk4）、細胞周期素依賴激酶 6（cdk6）[12]，使增殖期細胞不能通過“G1-S”調節點，阻滯增殖期細胞在G1期從而阻斷細胞周期的進展，進而影響細胞生長促進凋亡[13]。正因為這些作用，索拉菲尼已被FDA批準用于肝癌及腎癌的臨床治療。本研究結果證實索拉菲尼對小鼠宮頸癌細胞株U14移植瘤的VEGF有下調作用。

與索拉非尼具有潛在廣譜的抗腫瘤作用相比，貝伐單抗，即重組人抗血管內皮生長因子單克隆抗體,作為單靶點藥物，特異性高，可與人類各種VEGF高親和性結合，阻滯VEGF與受體結合，進而阻斷VEGF誘導的血管內皮細胞增殖、遷徙、存活，進而抑制內皮細胞通透性以及一氧化氮、組織因子的產生，抑制腫瘤血管生成[14]，從而有效地抑制腫瘤細胞生長和腫瘤轉移。本研究結果證實貝伐單抗對小鼠宮頸癌細胞株U14移植瘤的VEGF有下調作用。

細胞凋亡屬細胞主動性死亡，其對腫瘤的發生、發展、治療和預防都有非常重要的意義[15]，Bax可發揮促細胞凋亡作用。本研究結果提示索拉菲尼聯合貝伐單抗對小鼠宮頸癌細胞株U14移植瘤的Bax基因有上調作用，從而促進移植瘤細胞凋亡。

由于腫瘤的生長和轉移是多因素、多步驟作用的結果，因此作用于單靶點的藥物常常難以明顯起效，即使單靶點藥物對某一種酶或者受體具有較強的抑制作用，也不一定能夠真正地起到治療疾病的作用；多靶點抗腫瘤藥物的結構中含有作用于多個靶點的藥效基團，與腫瘤相關的多個靶點產生作用從而產生多種藥理活性，進而達到提高療效和改善安全性的目的[16]。故本課題利用多靶點藥物的高靈敏性與單靶點藥物的特異性相結合，通過聯合用藥彌補彼此間的不足，在多個環節上阻斷，從而達到理想的治療效果，本研究結果提示索拉菲尼聯合貝伐單抗聯合用藥對小鼠宮頸癌細胞U14移植瘤具有協同抑制作用。