甲狀腺乳頭狀癌中PBX3和PTEN的表達及其臨床意義

曹學全 阮正英 魏科娜 盧洪勝 蔡小波 戴岳楚 周璐青 顧華敏

甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是內分泌系統最常見的惡性腫瘤，約占甲狀腺癌的80%，大多數患者預后良好[1]。然而，10%～15%的PTC表現有侵襲性，容易復發、轉移并導致患者死亡。因此，闡明PTC的分子機制可能有助于發現新的治療靶點[2-3]。前B細胞白血病同源盒基因3（pre-B-cell leukemia homeobox gene 3，PBX3）是PBX家族的一個含有同源結構域的轉錄因子，在四肢、心臟等早期發育和細胞周期調控、維持胚胎干細胞未分化狀態等過程中具有廣泛的作用[4]。進一步研究表明，PBX3在胃癌[5]、肝細胞癌[6]和多發性骨髓瘤[7]等多種惡性腫瘤中存在過表達，且上調PBX3可促進腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移、細胞周期進展等惡性生物學行為。第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）通過去磷酸化磷脂酰肌醇（3,4,5）-三磷酸（PIP3）負性調節磷脂酰肌醇 3 激酶/蛋白激酶 B（PI3K/Akt）信號通路[8]，是一種重要的抑癌基因，在抑制腫瘤發生中發揮重要作用[9]。PTC中PBX3和PTEN表達是否存在相關性及PBX3表達與臨床病理特征的關系尚不清楚。本研究采用免疫組化En Vision二步法檢測PTC組織和癌旁正常甲狀腺組織中PBX3和PTEN的表達，分析兩者表達的特點及相關性，探討PBX3和PTEN表達改變與PTC發生、侵襲、轉移的關系及臨床意義。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2017年1月至2018年1月在臺州市中心醫院（臺州學院附屬醫院）住院行手術切除和石蠟包埋的PTC標本80例，術后常規病理診斷結果為PTC。所有患者術前均未接受放療、化療及生物學治療。80例PTC患者中，男26例，女54例；年齡21～77（45.37±12.04）歲，其中＜55歲 59例，≥55歲 21例；腫瘤直徑≤2 cm 56例，＞2 cm 24例；伴有包膜侵犯28例，無包膜侵犯52例；伴有淋巴結轉移47例，無淋巴結轉移33例；參照2018年第8版美國癌癥聯合委員會（AJCC）/國際抗癌聯合會（UICC）制定的甲狀腺癌分期標準進行TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期68例，Ⅲ～Ⅳ期12例。并選取癌旁正常甲狀腺組織（距離腫瘤≥2 cm）30例作為對照，經病理診斷均為正常甲狀腺組織。本研究經醫院醫學倫理委員會審查通過，所有患者均知情同意。

1.2 主要試劑 PBX3兔抗人多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，PTEN鼠抗人單克隆抗體、En Vision通用試劑盒及二氨基聯苯胺（DAB）均購自福州邁新生物技術有限公司。

1.3 PTC組織和癌旁組織中PBX3和PTEN蛋白表達檢測 采用免疫組化En Vision二步法。制作4 μm厚的石蠟切片，常規脫蠟至水。3% H2O2室溫孵育阻斷內源性過氧化物酶的活性，0.1 mmol/L枸櫞酸鹽緩沖液高壓水浴抗原修復，1%山羊血清封閉，滴加一抗（PBX3稀釋濃度為 1∶200，PTEN 為 1∶100）4 ℃冰箱過夜，第 2天滴加二抗（EnVision免疫組化檢測試劑），DAB顯色，蘇木素復染、鹽酸分化、梯度乙醇脫水、二甲苯透明和樹膠封片，顯微鏡下觀察PBX3和PTEN蛋白表達特點和陽性定位。以PBS代替一抗作陰性對照，PBX3用前列腺癌組織作陽性對照，PTEN用乳腺癌組織作為陽性對照。

1.4 結果判定 陽性細胞表現為淡黃色至棕褐色顆粒，PBX3陽性表達定位于細胞質，PTEN陽性表達定位于細胞核或細胞質。在光學顯微鏡下，每張切片隨機選取至少5個高倍視野（×400），每個視野計數200個細胞進行評分和記錄。每張切片根據半定量積分法進行判定，最終積分=染色強度和陽性細胞百分比的乘積。染色強度：無顯色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞百分比：＜10%為0分，10%～25%為1分，＞25%～50%為 2分，＞50%～75%為 3分，＞75%為4分。最終積分＜3分為陰性，≥3分為陽性。

1.5 統計學處理 采用SPSS 19.0統計軟件。計數資料組間比較采用χ2檢驗，PBX3和PTEN蛋白表達的相關性分析采用Spearman等級相關。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PTC組織和癌旁組織中 PBX3、PTEN的表達PTC組織中PBX3陽性表達率為73.75%（59/80），高于癌旁組織的16.67%（5/30），差異有統計學意義（χ2=29.220，P＜0.05）；PTC 組織中 PTEN 陽性表達率為35.00%（28/80），低于癌旁組織的 83.33%（25/30），差異有統計學意義（χ2=20.415，P＜0.05），見圖 1（插頁）。

2.2 PTC組織中PBX3、PTEN陽性表達與臨床病理特征的關系 包膜侵犯、淋巴結轉移和Ⅲ～Ⅳ期的PTC組織中PBX3陽性表達率分別高于無包膜侵犯、無淋巴結轉移和Ⅰ～Ⅱ期的PTC組織，差異均有統計學意義（均P＜0.05），而不同性別、年齡和腫瘤直徑PTC組織中PBX3陽性表達率比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。包膜侵犯、淋巴結轉移和Ⅲ～Ⅳ期的PTC組織中PTEN陽性表達率分別低于無包膜侵犯、無淋巴結轉移和Ⅰ～Ⅱ期的PTC組織，差異均有統計學意義（均P＜0.05），而不同性別、年齡和腫瘤直徑PTC組織中PTEN陽性表達率比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表1。

表1 PTC組織中PBX3、PTEN陽性表達與臨床病理特征的關系[例（%）]

2.3 PTC組織中 PBX3、PTEN蛋白表達的相關性Spearman等級相關分析顯示PTC組織中PBX3、PTEN蛋白表達呈負相關（r=-0.337，P＜0.05），見表 2。

3 討論

PBX3是PBX家族中的一個重要的轉錄因子，具有高度保守的同源結構域，通過與其他同源蛋白相互作用及序列5′-ATCAATCA-3′結合，導致轉錄激活或靶基因沉默[9-10]。近年研究顯示，PBX3在一些實體腫瘤及血液系統惡性腫瘤中的作用及分子機制已經成為國內外學者研究的熱點。據報道，在核仁磷酸蛋白1（nucle－ophosmin1，NPM1）突變的急性髓系白血病中，PBX3受同源框蛋白 A9（homeobox protein A9，HOXA9）的調控，特別是當HOXA9上調或下調時，PBX3的表達增加或減少。盡管HOXA9的表達不受PBX3的限制，但PBX3或HOXA9的丟失都會導致細胞凋亡，表明上調PBX3和HOXA9表達對NPM1突變細胞的存活至關重要[11]。生存分析顯示，高表達的HOXA9或PBX3與胃癌的低生存率相關，Cox回歸模型的多因素分析顯示PBX3表達是胃癌獨立的預后因素[12]。表明PBX3和其他同源蛋白通過調控作用在血液腫瘤及實體腫瘤中過表達，且與腫瘤的發生和預后相關。Li等[13]發現，宮頸癌細胞系及組織中PBX3表達上調，其表達與腫瘤直徑、病理分級、淋巴結轉移、浸潤深度、血管浸潤和臨床分期有關。PBX3可以通過Akt信號通路促進宮頸癌細胞增殖，并且可以作為預后的標志物。本研究結果顯示，PTC組織中PBX3陽性表達率高于癌旁組織，提示PBX3表達上調可能與PTC濾泡上皮癌變的發生有關。包膜侵犯、淋巴結轉移和Ⅲ～Ⅳ期的PTC組織中PBX3陽性表達率分別高于無包膜侵犯、無淋巴結轉移和Ⅰ～Ⅱ期的PTC組織，差異均有統計學意義。表明PBX3過表達與PTC的包膜侵犯、淋巴結轉移和高的臨床分期密切相關。而PBX3表達與PTC的直徑無關，與Li等[13]在宮頸癌中的研究結果不一致，可能與不同的腫瘤類型或樣本量少有關。

表2 PTC組織中PBX3、PTEN蛋白表達的相關性（例）

PTEN是第一個報道的具有磷酸酶活性的抑癌基因，是繼p53和視網膜母細胞瘤基因之后與腫瘤發生密切相關的抑癌基因，它通過阻斷PI3K/Akt信號通路調節細胞周期、抑制細胞增殖、促進細胞凋亡[14-15]。PTEN丟失可引起Akt介導的磷酸化和NF-κB活性增加，從而促進p53降解。p53降解降低了細胞凋亡能力并誘導了細胞周期進程[15]。Windarti等[16]對7項研究進行了系統評價，然后通過Meta分析評估PTEN丟失與乳腺癌預后的相關性。發現PTEN丟失與乳腺癌預后不良之間存在相關性，并且納入的研究沒有明顯的偏倚。該研究證實PTEN丟失是乳腺癌重要的獨立預后因素。本研究顯示，PTC組織中PTEN陽性表達率低于癌旁組織，且包膜侵犯、淋巴結轉移和Ⅲ～Ⅳ期的PTC組織中PBX3陽性表達率分別低于無包膜侵犯、無淋巴結轉移和Ⅰ～Ⅱ期的PTC組織，差異均有統計學意義。提示PTEN表達缺失或低表達在PTC發生、侵襲和轉移過程中起促進作用，采用免疫組化檢測PTEN蛋白表達特點可用于判斷PTC的侵襲、轉移能力。

PBX3和PTEN在PTC中的關系如何，目前尚不清楚。本研究采用Spearman等級相關分析從蛋白水平探討PTC中PBX3和PTEN表達的相關性，發現PBX3高表達，而PTEN低表達，兩者表達呈負相關，且與PTC的包膜侵犯、淋巴結轉移和臨床分期密切相關。綜合以上研究結果，PBX3和PTEN異常表達可能在PTC發生、侵襲、轉移的過程中起負向調控作用，兩者有望成為PTC診斷、預后評估及靶向治療的生物學指標。