基于多聚腺嘌呤的二嵌段寡核苷酸探針用于卡那霉素可視化檢測

摘要 單鏈DNA（Single-stranded DNA， ssDNA）在未修飾的裸金納米顆粒（AuNPs）上的吸附已成為基于核酸分子的比色分析的常用機制。本研究設計了一段包含多聚腺嘌呤（polyA20）尾部序列的二嵌段寡核苷酸探針（dP），構建了一種免標記的AuNPs 比色生物傳感器用于檢測卡那霉素（Kanamycin， Kana）。在卡那霉素存在的情況下，磁珠@雙鏈DNA（MBs@dsDNA）復合物上的卡那霉素適配體序列（Kana-Apt）與其特異性結合，導致dP 從磁珠表面釋放。由于polyA20 與AuNPs 之間有強吸附親和力， dP 被吸附在AuNPs 表面，從而在高鹽環境中保護AuNPs 不發生團聚。與具有相同堿基數量的隨機序列（Random sequence， RS）相比，利用含有polyA20 尾部序列的AuNPs 比色策略對卡那霉素的檢測靈敏度提高了2 個數量級。此比色傳感器對卡那霉素的線性檢測范圍為0.01～1 nmol/L，檢出限（LOD， S/N=3）為0.01 nmol/L。本方法無需大型儀器及其它信號放大策略，具有較高的靈敏度和特異性，適用于現場大批量樣品的快速、可視化和實時檢測，為其它抗生素以及影響食品安全的化學污染物的可視化檢測提供了新思路。

關鍵詞 卡那霉素；金納米顆粒；核酸適配體；生物傳感器；食品安全

卡那霉素（Kanamycin， Kana）是一種用于預防和治療微生物感染的廣譜氨基糖苷類抗生素，被用作農業和畜牧業中的飼料添加劑和獸藥[1]。然而，濫用卡那霉素的現象屢見不鮮，導致其在動物源性食品中殘留，進而經由食物鏈進入人體，通過積累效應危害公眾健康[2]。我國國家標準《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》（GB 31650—2019）[3]規定了不同食品中卡那霉素的最大殘留限量（Maximumresidue limits， MRLs），如牛奶中的MRL 為150 μg/kg，肌肉的MRL 為100 μg/kg?？敲顾氐臋z測方法主要包括色譜法[4]、酶聯免疫吸附分析法[5]和毛細管電泳法[6]等。但是，大多數方法需要專業的操作人員和高精度儀器的支持，在現場實時檢測和大批量篩查中的應用仍存在局限性。因此，建立簡單、靈敏和低成本的卡那霉素檢測方法對于保障食品安全和公眾健康具有重要的現實意義。

目前，基于新型納米材料構建的低成本、易小型化的生物傳感器受到了廣泛關注[7-8]。其中，比色生物傳感器因其具有操作簡單、成本低和可視化識別等特性而備受關注，在大批量樣品的篩查方面顯示出良好的應用潛能。金納米顆粒（Gold nanoparticles， AuNPs）的合成簡單且易于生物功能化，常作為比色生物傳感器的關鍵元件[9-10]。此外， AuNPs 表現出與粒子間距相關的表面等離子體特性[11-12]，為比色法的現場應用提供了優良的納米檢測平臺。值得注意的是，單鏈DNA（Single-stranded DNA， ssDNA）和雙鏈DNA（Double-stranded DNA， dsDNA）在未經修飾的AuNPs 上具有不同的吸附特性。由于ssDNA 具有柔性，更易吸附在AuNPs 上，而dsDNA 的剛性雙螺旋結構使其在AuNPs 表面的吸附較差[13]。基于此原理的AuNPs 比色傳感策略已被廣泛應用于許多領域，特別是食品安全現場篩查和個人醫療保健中的即時檢測（Point-of-care testing， POCT）[14-15]。盡管該類免標記比色法簡便快速，但其主要依賴于ssDNA 對AuNPs 的吸附親和力，導致檢測靈敏度受限。不同的DNA 堿基與AuNPs 表面相互作用的方式不同[16]。已有研究證實，相比于隨機序列的DNA，多聚腺嘌呤（Poly-adenine， polyA）對AuNPs 表現出更高的吸附親和力[17-18]，這種獨特性質使得polyA 在生物分子編程、生物傳感器和新型藥物遞送等研究領域得到了廣泛應用[19-21]。然而，基于polyA 和AuNPs 之間高吸附親和力的比色分析研究仍然較少[22]。

在傳統AuNPs比色策略的基礎上，本研究構建了一種基于二嵌段寡核苷酸探針（Diblock oligonucleotideprobe， dP）的免標記比色適配體傳感器用于卡那霉素的檢測。與含相同堿基數量的隨機序列（Randomsequence， RS）相比，在不依賴任何信號放大技術的情況下，利用含有polyA20 尾部序列的AuNPs 比色策略對卡那霉素的檢測靈敏度提高了2 個數量級，線性檢測范圍為0.01～1 nmol/L，檢出限為0.01 nmol/L，并可實現裸眼檢測，具有良好的特異性。本方法克服了比色傳感器檢測靈敏度低的問題，實現了卡那霉素的可視化靈敏檢測。