熊果酸對1型糖尿病大鼠轉錄因子T?bet/GATA?3表達的影響

宋超杰 張小莉 陳維維 于瑩瑩 陳換換

河南中醫藥大學（鄭州450046）

1 型糖尿病（type 1 diabetes，T1DM）是胰島β細 胞受損導致胰島素絕對缺乏的慢性自身免疫性疾病，常表現為外源性胰島素依賴［1］。患者以青少年為主，部分發病急，血糖波動大，易發生視網膜病變［2］、酮癥酸中毒，甚至死亡。目前，T1DM 的治療仍以終身注射胰島素為主［3］，新型治療手段包括胰島移植［4］、干細胞療法［5］等，但由于供體有限、技術要求高、費用昂貴等因素，仍不能取代胰島素療法；若長期注射胰島素，可使機體產生胰島素抗體，血糖不穩定易造成慢性心血管并發癥［6］，因此尋找新的替代藥物顯得尤為重要。

現有研究［7-8］表明Th1/Th2 細胞分化失衡并偏向Th1 方向可導致T1DM 發生，糾正Th1/Th2 細胞失衡可改善T1DM［9］。轉錄因子T?bet、GATA?3 分別在Th1 和Th2 細胞中特異性表達，是Th0 細胞分化方向的重要決定因素，T?bet/GATA?3 表達比值的變化可反映Th1/Th2 分化狀況與自身免疫性疾病發病機制、發展和預后的關系［10］。最新研究［11］表明，下調T?bet 的表達可糾正Th1/Th2 細胞失衡從而改善T1DM。中藥提取物熊果酸（ursolic acid，UA），具有降糖、降脂、抑菌、抗氧化等作用［12-15］，但UA 的降糖機制尚在研究，UA 能否通過調控轉錄因子T?bet、GATA?3 的表達發揮降糖作用，目前尚無相關研究。

本研究通過復制T1DM 大鼠模型，UA 灌胃6 周后，檢測T?bet、GATA?3 的轉錄及蛋白表達情況，探討UA 能否通過調控T?bet、GATA3 的表達，糾正Th1/Th2 細胞因子失衡，從而發揮降糖作用，對尋找治療T1DM 的藥物作用新靶點及UA 的臨床應用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和試劑

1.1.1 試劑UA（純度95%，畢得醫藥，批號：WG0009285?180525001）；鹽酸二甲雙胍片（0.25 g/片，上海上藥信宜藥廠有限公司，批號：48171122）；鏈脲佐菌素（純度98%，北京Solarbio 生物科技有限公司，批號：S49163）；大鼠胰島素（INS）ELISA 試劑盒（Invitrogen 公司，批號：0743021419）；大鼠IL?2（批號：12113112813）、IL?4（批號：1281475824）ELISA試劑盒、兔多抗GATA3（48 KD）（批號：BA0885）、兔多抗T?bet（TBX21，58 KD）（批號：BA1711）、辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗（批號：BA1054）均購自武漢博士德生物工程有限公司；大鼠insulin 抗體（批號：LS192819）、HRP 標記山羊抗兔試劑盒（批號：HP191908）均購自武漢塞維爾生物科技有限公司；BCA 蛋白測定試劑盒（碧云天公司，批號：P0010）；兔多抗GAPDH（賢至生物有限公司，批號：AB?P?R 001）；ECL 底物液（Thermo 公司，批號：NCI5079）；X 光膠片（柯達公司，批號：XBT?1）；顯影定影試劑盒（天津市漢中攝影材料廠）；總RNA提取試劑盒（Solarbio 公司，批號：R1200）；逆轉錄試劑盒、SYBR Green 核酸染料（諾唯贊）；PCR 引物合成（江蘇金唯智生物科技有限公司）。

1.1.2 儀器血糖儀（魚躍醫療設備股份有限公司）；酶標儀（Thermo 公司）；垂直電泳槽（北京六一儀器廠，型號：DYCZ?24DN）；垂直濕轉膜槽（美國Bio?Rad 公司，型號：Trans?Blot Cell）；電泳儀電源（美國Bio?Rad 公司，型號：DYY?7C）；實時熒光定量PCR 儀（ABI 公司，型號：7500）；脫色搖床（美國Kylin?Bell Lab Instruments 公司，型號：TS?2）。

1.1.3 動物60 只Wistar 大鼠，雄性，6 周齡，170～180 g，SPF 級，購自濟南朋悅有限公司，許可證號：SCXK（魯）20140007。飼養于河南中醫藥大學動物實驗中心，許可證號：SYXK（豫）2015?0005，動物倫理編號：DWLL2018030032；飼料購自江蘇省協同醫藥生物工程有限公司，許可證號：蘇飼證（2014）01008。

1.2 方法

1.2.1 造模及給藥60 只健康雄性Wistar 大鼠，IVC 獨立通風，隨機分空白組（n=10）、造模組（n=50）。適應性喂養7 d 后，造模組以55 mg/kg 劑量一次性腹腔注射1%鏈脲佐菌素，空白組注射等體積檸檬酸?檸檬酸鈉緩沖液。7 d 后，連續3 d 在同一時間檢測空腹血糖，若≥16.7 mmol/L，視造模成功。造模成功大鼠再隨機分為模型組（n=12）、二甲雙胍組（n=12）和UA 組（n=12）。治療組每天灌胃100 mg/kg 相應藥物，空白組和模型組用等體積羧甲基纖維素鈉溶液（5 g/L）灌胃，根據各組大鼠每周的體質量，調整灌胃藥物的體積，持續6 周后，麻醉取材。

1.2.2 樣本采集麻醉后，經腹主動脈采集血液，待血液凝固后4 ℃離心分離血清裝入凍存管，立即轉入液氮速凍，之后轉入-80 ℃凍存。分離胰腺，放入4%甲醛溶液中固定；分離脾臟，立即裝入凍存管，先轉液氮速凍，之后-80 ℃凍存。

1.2.3 一般情況每天觀察并記錄大鼠活動；每周同一時間測體質量、空腹血糖，測空腹血糖時空腹8 h，禁食不禁水，尾尖采血。

1.2.4 免疫組化染色觀察胰腺病理改變胰腺固定24 h后，按照試劑盒說明進行脫水、包埋、4 μm 切片，進行胰島素的免疫組化染色，光鏡下觀察胰島破壞及炎癥浸潤情況。

1.2.5 ELISA法檢測血清中INS、IL?2、IL?4的表達量嚴格按照說明書上步驟進行操作，用450 nm波長檢測OD 值，繪制標準曲線，依據標準曲線計算濃度。

1.2.6 qRT?PCR 法檢測T?bet、GATA?3 mRNA 表達用RNA 提取試劑盒提取脾臟總RNA，微型分光光度計檢測A260/A280比值，用20 μL 反應體系即：2×RT Mix 10 μL；HiScript ⅡEnzyme Mix 2 μL；Oligo（dT）23VN（50 μmol/L）1 μL；Random hexamers（50 ng/μL）1 μL；Total RNA 1 pg?1 μg（根據所測得RNA濃度而定）；RNase free ddH2O 加至20 μL，退火：25 ℃，5 min；延伸：50 ℃，15 min；失活：85 ℃，2 min，逆轉錄為cDNA，-20 ℃凍存；用20 μL 反應體系（2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL；Primer1 0.4 μL；Primer2 0.4 μL；Template cD?NA 1 μL；ddH2O 8.2 μL），95 ℃5 min 預變性，95 ℃10 s，60 ℃60 s，40 個循環擴增，繪制溶解曲線用2?△△CT法計算基因的相對表達量。PCR 引物設計如下：β?actin 正義鏈：5′?CACCCGCGAGTA?CAACCTTC?3′；反義鏈：5′?CCCATACCCACCATCA?CACC?3′；T?bet 正 義 鏈5′?AAGGCAGTATGC?CAGGGAAC?3′；反義鏈：5′?TTGGAGCCCCCTTGTT?GTT?3′；GATA?3 正義鏈：5′?ATGGAGGTGACTACG?GACCA?3′；反義鏈：5′?TAGTAGGACGGGACGTG?GTT?3′。

1.2.7 Western blot 法檢測T?bet、GATA?3 蛋白表達脾臟勻漿提取總蛋白，測定濃度、電泳、轉膜、一抗孵育，洗膜，二抗孵育，洗膜，ELC 顯色，掃描，BandScan 分析計算灰度值。

1.3 統計學方法采用SPSS 22.0軟件分析，計量資料用均數±標準差表示，組間比較用單因素方差分析（One?way ANOVA），以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況正常組毛發柔順亮白，靈活好動；模型組出現“三多一少”癥狀，毛發潮濕枯黃，精神倦怠，死亡2 只。UA 組與二甲雙胍組“三多一少”癥狀改善，毛發干燥泛黃，精神好轉；與模型組比，UA 組體質量持續增加（P< 0.01），空腹血糖降低（P<0.01）。見表1、2。

表1 UA 對T1DM 大鼠體質量的影響Tab.1 Effect of UA on body weight of T1DM rats ±s，g

表1 UA 對T1DM 大鼠體質量的影響Tab.1 Effect of UA on body weight of T1DM rats ±s，g

注：與空白組比，**P<0.01，*P<0.05；與模型組比，##P<0.01，#P<0.05

組別UA 組模型組二甲雙胍組空白組例數12 10 12 10灌胃0 周192.83±16.27 190.50±10.85**204.83±7.01 246.33±12.17灌胃2 周257.00±14.04##183.80±10.85**263.42±12.71##323.83±19.73灌胃4 周304.33±19.31##193.10±8.61**282.00±16.02##366.00±28.71灌胃6 周321.42±14.66##201.60±7.51**296.42±23.03##411.75±32.11

表2 UA 對T1DM 大鼠空腹血糖的影響Tab.2 Effect of UA on fasting blood glucose in T1DM rats ±s，mmol/L

表2 UA 對T1DM 大鼠空腹血糖的影響Tab.2 Effect of UA on fasting blood glucose in T1DM rats ±s，mmol/L

注：與空白組比，**P<0.01，*P<0.05；與模型組比，##P<0.01，#P<0.05

組別UA 組模型組二甲雙胍組空白組例數12 10 12 10灌胃0 周25.19±4.58 28.57±2.82**27.23±3.98 6.01±0.60灌胃2 周18.28±4.52#29.44±2.64*18.09±3.67##5.00±0.66灌胃4 周12.2±2.98#28.72±2.81*12.03±2.42##4.93±0.46灌胃6 周8.98±2.61##26.64±2.67**8.81±1.91##4.88±0.49

2.2 血清胰島素變化與空白組比，模型組血清胰島素含量降低（P< 0.01）；與模型組比，二甲雙胍組、UA 組胰島素含量升高（P<0.01），見表3。

表3 UA 對T1DM 大鼠血清INS 的影響Tab.3 Effects of UA on serum insulin in T1DM rats ±s，μIU/mL

表3 UA 對T1DM 大鼠血清INS 的影響Tab.3 Effects of UA on serum insulin in T1DM rats ±s，μIU/mL

注：與空白組比，**P<0.01，*P<0.05；與模型組比，##P<0.01，#P<0.05

組別UA 組模型組二甲雙胍組空白組例數12 10 12 10 INS（μIU/mL）13.64±2.07##5.70±0.73**13.38±2.30##15.17±2.18

2.3 病理改變蘇木素染細胞核為藍色，DAB 顯出的胰島素陽性表達為棕黃色。空白組胰島β細胞胞漿豐富、胞核藍染，整齊排列；模型組胰島萎縮，胰島β細胞明顯減少，排列散亂，部分出現水腫、空泡樣變性、組織間隙炎性細胞浸潤；二甲雙胍組、UA 組胰島邊界較清晰，形態較規則，胰島β細胞分布較均勻，水腫變性得到抑制，組織損傷程度減輕，見圖1。

2.4 IL?2、IL?4 變化與空白組比，模型組血清IL?2 含量升高（P< 0.01）、IL?4 降低（P< 0.01）；與模型組比，UA 組IL?2 表達量降低（P< 0.01），IL?4升高（P<0.01），見表4。

2.5 T?bet、GATA?3 mRNA變化與空白組比，模型組脾臟T?bet mRNA 水平升高（P< 0.01），GATA?3 mRNA 降低（P< 0.01），T?bet/GATA?3 比值升高（P<0.01）；與模型組比，UA 組T?bet mRNA 表達量降低（P<0.01），GATA?3 mRNA 升高（P<0.05），T?bet/GATA?3比值降低（P<0.01），如表5、圖2所示。

圖1 UA 對T1DM 大鼠胰腺病理變化的影響（HE，×400）Fig.1 Effect of UA on pathological changes of pancreas in T1DM rats（HE，×400）

表4 UA 對T1DM 大鼠IL?2、IL?4 表達量的影響Tab.4 Effect of UA on the expression of IL?2 and IL?4 in T1DM rats ±s

表4 UA 對T1DM 大鼠IL?2、IL?4 表達量的影響Tab.4 Effect of UA on the expression of IL?2 and IL?4 in T1DM rats ±s

注：與空白組比，**P<0.01，*P<0.05；與模型組比，##P<0.01，#P<0.05

組別UA 組模型組二甲雙胍組空白組例數12 10 12 10 IL?2（pg/mL）92.10±1.12##147.5±2.01**106.97±4.17##87.57±1.11 IL?4（pg/mL）59.37±3.47##41.87±0.34**56.03±2.70##60.73±7.52

表5 UA 對糖尿病大鼠脾臟內T?bet、GATA?3 mRNA 表達量的影響Tab.5 Effect of UA on the expression of T?bet and GATA?3 mRNA in spleen of diabetic rats ±s

表5 UA 對糖尿病大鼠脾臟內T?bet、GATA?3 mRNA 表達量的影響Tab.5 Effect of UA on the expression of T?bet and GATA?3 mRNA in spleen of diabetic rats ±s

注：與空白組比，**P<0.01，*P<0.05；與模型相比，##P<0.01，#P<0.05

組別UA 組模型組二甲雙胍組空白組例數6 6 6 6 T?bet mRNA 1.50±0.23##2.75±0.66**1.32±0.26##1 GATA?3 mRNA 0.67±0.037#0.17±0.06**1.04±0.22##1

圖2 T?bet、GATA?3 的mRNA 表達量比值Fig.2 Expression ratio between T?bet and GATA?3 mRNA

2.6 T?bet、GATA?3蛋白表達情況與空白組比，模型組脾臟T?bet 蛋白水平升高（P< 0.01），GATA?3蛋白水平下調（P<0.01）；與模型組比，UA 組T?bet蛋白水平下降（P< 0.01），GATA?3 水平上升（P<0.01），見表6、圖3。

表6 UA 對糖尿病大鼠脾臟內T?bet、GATA?3 蛋白表達量的影響Tab.6 Effect of UA on the expression of T?bet and GATA?3 protein in spleen of diabetic ±s

表6 UA 對糖尿病大鼠脾臟內T?bet、GATA?3 蛋白表達量的影響Tab.6 Effect of UA on the expression of T?bet and GATA?3 protein in spleen of diabetic ±s

注：與空白組比，**P<0.01，*P<0.05；與模型組比，##P<0.01，#P<0.05

組別UA 組模型組二甲雙胍組空白組例數6 6 6 6 T?bet 0.17±0.00##0.68±0.03**0.31±0.02##0.10±0.00 GATA?3 0.61±0.06##0.12±0.02**0.41±0.04##0.69±0.03

圖3 UA 對T1DM 大鼠脾臟內T?bet、GATA?3 蛋白表達水平影響Fig.3 Effect of UA on T?bet and GATA?3 protein expression in spleen of T1DM rats

3 討論

目前，中國T1MD 患者（0～19 歲）居世界第4 位［16］，患者常起病急，易出現酮癥酸中毒、視網膜病變等并發癥，嚴重影響患者身心健康［17-18］。目前治療T1DM 的金標準為胰島素注射，但患者需終身用藥［3］；胰島移植、干細胞療法及中藥治療效果明顯，其作用機制尚在研究［5，19-20］。UA 為中藥提純物，存在于山楂、女貞子、車前草等植物［21］，具有降糖、抗菌消炎、抗腫瘤等作用［22-23］。但其降糖作用機制尚在研究。

T1DM 的發病機制中，除自身抗體外［24］，現有研究表明，Th1/Th2 細胞分化失衡偏向Th1 方向和由此產生的細胞因子表達量的改變在T1DM 發病機理中起重要作用［8］。DUAN 等［25］通過二甲雙胍抑制NOD 小鼠的Th1 及Th17 細胞分化可改善其自身免疫性胰島炎。轉錄因子T?bet 特異性表達于Th1 細胞。GATA?3 控制CD4+T 細胞分化，調控Th2 細胞。轉錄因子T?bet/GATA?3 可能在疾病發生發展過程中，通過參與正向或負向調控Th1/Th2的分化來維持平衡，達到減輕、治療疾病目的［26］。TANG 等［27］通過抗CD20 單克隆抗體與腺病毒載體介導的IL?10 組合上調NOD 小鼠GATA3 及IL?4 的表達，下調T?bet 的表達，發現其對早期NOD 小鼠的胰島β細胞具有保護作用。IL?2 為Th1 型細胞因子，過表達可使CD4+T 細胞表達粘附分子高，損傷β細胞，誘發T1DM［28］；IL?4 主要由Th2 細胞產生，ALLAM 等［29］通過使用具有序列特異性引物的PCR 對300 例T1DM 患者和300 例對照受試者細胞因子單核苷酸多態性進行分析，發現IL?4?590C/T TT 純合子比CC 基因型更容易發生T1DM，IL?4 T等位基因與T1DM 患者之間有一定聯系。臍帶間充質干細胞移植可增加IL?4 水平，糾正Th1/Th2 失衡，降低血糖，改善T1DM 癥狀［30］。因此，通過調控T?bet/GATA?3 進而糾正Th1/Th2 細胞及細胞因子失衡是改善T1DM 關鍵。本研究結果表明，與模型組比，UA 可使轉錄因子GATA?3 轉錄增加、表達上調，T?bet 轉錄及表達下降，T?bet/GATA?3 比值升高，細胞因子IL?2 含量降低，IL?4 升高，說明UA 作用后，在轉錄因子T?bet/GATA?3 的調控下，Th1/Th2型細胞因子的表達開始偏向Th2 方向，Th1/Th2 細胞因子分化失衡狀況得到糾正，T1DM 得以改善，與上述研究結果一致。MA 等［31］研究發現UA 通過作用于靶點CASP3、ERK1 和JNK2，減輕炎癥相關下游多種信號轉導因子，具有抗炎活性，由此可推斷UA 可能通過作用于上述靶點，進而下調T?bet的表達，從而抑制Th1 細胞分化，改善T1DM。

由于樣本量有限，本實驗只探討了UA 調控轉錄因子T?bet/GATA?3 的表達，但其具體調控途徑尚未可知，還需使用相關的抑制劑和激動劑進一步探討，以確定T?bet/GATA?3 的關鍵作用，這將在本課題的下一步研究中繼續探討。

綜上所述，本研究表明中藥提取物UA 能夠通過下調T?bet、上調GATA?3 的表達，增加Th1 型細胞因子IL?2 的表達，降低Th2 型細胞因子IL?4 的表達，進而糾正Th1/Th2 細胞分化失衡，從而抑制胰腺炎癥反應、降低血糖，有效改善T1DM。本研究可為UA 降糖機制的闡明及臨床應用提供重要理論支持。