對GB 8538-216《食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法》中產氣莢膜梭菌檢驗的研究與改進

黃薇臻

摘 要：以中國檢科院測試評價中心（ACAS）組織的礦泉水中產氣莢膜梭菌的檢測能力驗證、測量審核為例，實驗檢驗使用標準GB 8538-2016《食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法》，實驗過程濾膜上的菌落在亞硫酸鹽-多粘菌素-磺胺嘧啶瓊脂（SPS）經24 h厭氧環(huán)境培養(yǎng)后黑色菌落不明顯，甚至不生長黑色菌落影響后續(xù)確認性實驗，以及確證性實驗中含鐵牛乳培養(yǎng)基“暴烈發(fā)酵”實驗現象不明顯，針對此現象進行研究與改進。

關鍵詞：產氣莢膜梭菌;檢驗;改進

Abstract：Taking the testing ability verification and measurement audit of clostridium perfringens in mineral water organized by the Testing and Evaluation Center of the Chinese Academy of Sciences （ACAS） as an example， the test used standard GB 8538-2016 Inspection Method for Drinking Natural Mineral Water in National Standard for Food Safety”. In the process of the experiment， black colonies on the filter membrane were not obvious after 24h anaerobic culture of sulfite - polymyxin - sulfadiazine （SPS）. And there was no black colonies which influenced subsequent confirmatory experiments. The “violent fermentation” of iron-containing milk medium was also not obvious in the confirmatory experiment. Research and improvement were performed based on this.

Key words：Clostridium perfringens; Testing; Improvement

中圖分類號：R123.1

產氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）為厭氧芽胞菌，是引起食源性胃腸炎常見的病原菌，該菌能引起氣性壞疽和食物中毒。由該菌引發(fā)的食物中毒為食入被大量（108～109）細菌繁殖體污染的食物（主要為肉類食物）而引起，潛伏期大約10 h，臨床表現為腹痛、腹脹、水樣腹瀉，無熱、無惡心嘔吐現象，1～2 d可自愈，如不進行細菌學檢查常難確診。

針對產氣莢膜梭菌的致病性GB 8537-2018《食品安全國家標準 飲用天然礦泉水》微生物限度規(guī)定n=5，c=0，m=0 CFU/50 mL，即抽樣5份，檢驗5份，不得檢出。根據平常監(jiān)督抽檢和風險監(jiān)測檢驗，檢出率很低，并且這是計數定量類型檢驗，所以很難發(fā)現GB 8538-2016檢驗方法實驗過程中的問題。參加了中國檢科院測試評價中心（ACAS）組織的礦泉水中產氣莢膜梭菌的檢測能力驗證，并且同時進行陽性菌驗證，發(fā)現在實驗過程中，陽性菌和能力驗證樣品在亞硫酸鹽-多粘菌素-磺胺嘧啶瓊脂（SPS）均不顯黑色，但GB 8538-2016規(guī)定挑取SPS平板上過濾法過濾水樣后生長的可疑黑色菌落3～5個，分別接種FT培養(yǎng)基進行后續(xù)確證性實驗。所以產氣莢膜梭菌在SPS平板上不顯現黑色，則會被定義為非疑似菌落，會導致漏檢，不能真實反映樣品中產氣莢膜梭菌的存在情況。并且確認性實驗中，GB 8538-2016規(guī)定取生長旺盛的FT培養(yǎng)液1 mL接種于含鐵牛乳培養(yǎng)基，在46 ℃水浴中培養(yǎng)2 h后觀察有無“暴烈發(fā)酵”現象發(fā)生，在5 h內不發(fā)酵者為陰性。經過實際試驗，發(fā)現即使陽性菌也不能5 h內產生“暴烈發(fā)酵”現象，以此為根據很容易出假陰性實驗結果。為解決這些問題，本文對標準中的檢驗方法進行了研究與改進。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

產氣莢膜梭菌菌種，編號：ATCC 13124。經復蘇純化后，VITEK鑒定為產氣莢膜梭菌陽性菌株。

1.1.2 能力驗證樣品

總編號：ACAS-PT738，分為兩個樣品：19-K292（有100稀釋級以內的菌落）、19-G591（有100～200稀釋級以內菌落）。

1.1.3 測量審核樣品

總編號：ACAS-MA20，分為兩個樣品：MA20-A522、

MA20-A843

1.1.4 主要儀器

高壓滅菌鍋（型號：YXQ-LS-75G，上海博迅）;生物安全柜（型號：AC2-6S1，新加坡藝思高）;培養(yǎng)箱（型號：BSP-250，上海博迅）。

1.1.5 主要試劑耗材

亞硫酸鹽-多粘菌素-磺胺嘧啶瓊脂（SPS）、胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸（TSC）瓊脂、2液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（FT）、動力-硝酸鹽培養(yǎng)基、BHI培養(yǎng)液、含鐵牛奶培養(yǎng)基、卵黃瓊脂培養(yǎng)基、硝酸鹽還原試劑、乳糖-明膠培養(yǎng)基、0.1% 蛋白胨水。

1.2 試驗方法

1.2.1 能力驗證樣品按GB 8538-2016試驗

按能力驗證樣品說明復原520 mL水樣，等同于一個完整待測礦泉水水樣。按GB 8538-2016《食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法》用0.1%蛋白胨水稀釋4個稀釋級，在用孔徑0.22 μm的濾膜過濾，然后將濾膜移至SPS瓊脂培養(yǎng)基平板上，倒置于36 ℃厭氧培養(yǎng)24 h觀察結果。

1.2.2 產氣莢膜梭菌陽性菌模擬樣品GB 8538-2016試驗

陽性菌產氣莢膜梭菌復蘇后直接吸取含菌復蘇液1 mL加入520 mL滅菌水模擬含菌樣品，等同于一個完整待測礦泉水樣。按GB 8538-2016用0.1%蛋白胨水稀釋7個稀釋級，在用孔徑0.22 μm的濾膜過濾，然后將濾膜移至SPS瓊脂培養(yǎng)基平板和TSC瓊脂平板上，并在濾膜上鋪一層相同于底層的培養(yǎng)基均勻覆蓋整個表面，倒置于36 ℃厭氧培養(yǎng)24 h觀察結果。

1.2.3 測量審核樣品按GB 8538-2016試驗

按能力驗證樣品說明復原520 mL水樣，等同于一個完整待測礦泉水水樣。按GB 8538-2016《食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法》用0.1%蛋白胨水稀釋4個稀釋級，在用孔徑0.22 μm的濾膜過濾，然后將濾膜移至SPS瓊脂和培養(yǎng)基平板和TSC瓊脂平板上[2]，并在濾膜上鋪一層相同于底層的培養(yǎng)基均勻覆蓋整個表面，倒置于36 ℃厭氧培養(yǎng)24 h觀察結果。

2 結果與分析

2.1 能力驗證樣品按GB 8538-2016試驗結果分析

由圖1知，在4個稀釋級中，均無發(fā)現黑色菌落，與檢驗依據標準中“產氣莢膜梭菌在SPS瓊脂上顯黑色[1]”不一致，在平板上，肉眼可見僅有灰白色大顆菌落和黃色小顆菌落。同時用陽性菌產氣莢膜梭菌畫線SPS瓊脂平板，也均無黑色菌落（見圖2）。再次復試實驗，同時也用GB 4789.13-2012《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 產氣莢膜梭菌檢驗》中使用的TSC平板進行試驗，因實驗原液放入冰箱4 ℃保存，已經檢測不出菌落，查詢資料產氣莢膜梭菌是厭氧噬熱菌，放入冰箱凍存極有可能已經失活。所以如果按照GB 8538-2016實驗，在此步驟中，即使樣品中含有產氣莢膜梭菌，實際按照此方法試驗不出黑色菌落，則會被定義為非疑似菌落而不繼續(xù)進行鑒定，最后產生假陰性結果。

2.2 產氣莢膜梭菌陽性菌模擬樣品GB 8538-2016試驗結果分析

由圖3知，結果發(fā)現各稀釋級均能產生出黑色菌落，無灰白色菌落產生，除了濃度較高在濾膜上黑色菌落疊加而邊緣模糊。挑取黑色菌落進行產氣莢膜梭菌生化鑒定，陽性菌產氣莢膜梭菌也接種FT培養(yǎng)基作為陽性對照，經試驗所有生化鑒定均符合產氣莢膜梭菌生化反應除牛奶發(fā)酵實驗，按GB 8538-2016要求“取接種過黑色菌落生長旺盛的FT接種于含鐵牛乳培養(yǎng)基，在46 ℃水浴中培養(yǎng)2 h后觀察有無“暴烈發(fā)酵”現象發(fā)生，在5 h內不發(fā)酵者為陰性”，試驗結果不管是目標菌還是陽性菌并不能在規(guī)定的5 h內有“暴烈發(fā)酵”的現象，分析可能原因為直接接種進含鐵牛乳培養(yǎng)基試管，菌液在上表面，而產氣莢膜梭菌為厭氧菌，菌液在表面與空氣接觸會影響牛奶發(fā)酵實驗。再次進行實驗，把菌液通過移液管插入生長旺盛的FT底部接種，這樣可以排除空氣接觸的影響，經過試驗結果還是不管是目標菌還是陽性菌并不能在規(guī)定的5 h

內有“暴烈發(fā)酵”的現象，分析原因可能是目標菌即使在FT中經過24 h培養(yǎng)活力仍然不足以是含鐵牛乳在5 h內“暴烈發(fā)酵”，標準中可能對牛奶發(fā)酵實驗的時間要求過于苛刻。為了證明此觀點，進行實驗驗證，用能力驗證中的雜菌（非產氣莢膜梭菌）接種

2支含鐵牛乳培養(yǎng)基、黑色菌落目標菌插入底部接種

5支、表面接種5支，產氣莢膜梭菌陽性對照菌底部接種5支，表面接種5支觀察實驗結果，在水浴培養(yǎng)5 h仍沒有任何一支含鐵牛乳培養(yǎng)基產生“暴烈發(fā)酵”的現象，只能繼續(xù)水浴培養(yǎng)18 h，結果為：含鐵牛乳培養(yǎng)基接種雜菌的2支均無現象;目標菌落表面接種的5支中3支產生“暴烈發(fā)酵”現象，插入底部接種的5支均產生了“暴烈發(fā)酵”的現象;產氣莢膜梭菌陽性菌表面接種的5支中4支產生“暴烈發(fā)酵”現象，插入底部接種的5支均產生了“暴烈發(fā)酵”的現象。水浴培養(yǎng)到24 h，結果并沒有變化，繼續(xù)培養(yǎng)到48 h，結果仍然沒有變化。經過實驗證明，含鐵牛乳“暴烈發(fā)酵”實驗如果按國家標準的要求46 ℃水浴培養(yǎng)，

5 h內不發(fā)酵為陰性，則會產生因陽性菌活力不足不能使含鐵牛乳“暴烈發(fā)酵”報告假陰性結果，所以應對GB 8538-2016進行改進：取接種過黑色菌落生長旺盛的FT插入底部接種含鐵牛乳培養(yǎng)基，在46 ℃水浴中培養(yǎng)18 h后觀察有無“暴烈發(fā)酵”現象發(fā)生，在24 h內不發(fā)酵者為陰性。

2.3 測量審核樣品按GB 8538-2016試驗結果分析

由圖4知，試驗結果因為覆蓋了表面已經均能生長黑色菌落，無灰白色菌落產生，但在SPS瓊脂平板的濾膜上，菌落灰黑色，菌落整顆比較小且邊緣模糊并且有菌落連片生長黏連一起，只有計數兩個1∶10稀釋度的SPS平板分別為10和15（見圖5、6），而在TSC瓊脂平板菌落呈炭黑色，菌落邊緣清晰整齊，分布較均勻在濾膜上，計數兩個1∶10稀釋度的TSC平板分別為11和12（見圖7、8）。按GB 8538-2016要求挑取黑色菌落進行產氣莢膜梭菌生化鑒定，SPS平板濾膜上的菌落比較模糊，黏連一片比較難挑取，而TSC平板濾膜上菌落清晰，扁圓狀貼在濾膜和覆蓋的培養(yǎng)基之間，容易挑取，甚至可以整顆挑出。同時挑取SPS平板上和TSC平板的黑色菌落進行產氣莢膜梭菌生化鑒定，陽性菌產氣莢膜梭菌也接種FT培養(yǎng)基作為陽性對照，經試驗所有生化鑒定均符合產氣莢膜梭菌生化反應，按“插入底部接種含鐵牛乳，水浴培養(yǎng)18 h”的改進方式進行含鐵牛乳“暴烈發(fā)酵”實驗，挑取SPS平板和TSC平板上的黑色菌落各

10顆，陽性菌產氣莢膜梭菌平行接種做對照，結果TSC平板黑色菌落接種的含鐵牛乳產生“暴烈發(fā)酵”有9支（見圖9），SPS平板黑色菌落接種的有6支（見圖10）。通過實驗對比發(fā)現相較于GB 8538-2016推薦使用的SPS培養(yǎng)基，GB 4789.13-2012中計數使用的TSC培養(yǎng)基對礦泉水中產氣莢膜梭菌在濾膜上顯現黑色更具有明顯性和特異性。SPS培養(yǎng)基的原理在于產氣莢膜梭菌具有還原亞硫酸鹽的能力，把SPS培養(yǎng)基中的亞硫酸鹽還原為硫化物，再與檸檬酸鐵銨反應產生黑色沉淀，使菌落呈黑色[3]。而TSC培養(yǎng)基是