復合酶解法制備大豆肽的試驗

師景雙，袁超，李靜，于艷艷，馮煒，任雪梅*

1. 山東省食品藥品檢驗研究院（濟南 250101）；2. 山東省藥學科學院，山東省生物藥物重點實驗室（濟南 250101）

大豆營養價值極高，含有蛋白質、脂肪、膳食纖維、礦物質等多種營養物質[1]，特別是其中含有豐富的優質蛋白。大豆蛋白中不含膽固醇，是植物蛋白中為數不多的可替代動物蛋白的品種之一[2]。但是由于大豆蛋白分子結構復雜，相對分子量較大，溶解性低，消化率相對較差[3]，因此，近年來大豆的深加工越來越得到人們的重視，其中利用大豆蛋白生產大豆肽成為了一個重要的研究方向[4]。大豆肽是利用大豆、大豆蛋白、豆粕等經過化學作用、酶解作用或者生物發酵等方式生產的多種低分子肽的混合物[5]，相對分子質量小于1 000 Da，主要出峰位置在相對分子質量為300～700 Da[6-7]，主要成分為3～6個氨基酸組成的小分子肽，此外還含有少量大分子肽、游離氨基酸等成分[8]。大豆肽具有分子量小、溶解性能好、吸水性能強等特點，因此更易于被人體消化吸收[9-10]。研究發現大豆肽在小腸的吸收速度是大豆蛋白質的4倍，是氨基酸的1.5倍[11]。除此之外大豆肽還具有低抗原性、調節免疫、抗疲勞、抗氧化、降血脂等諸多生理功能，被廣泛應用于功能食品配料和藥物原料之中[12-13]。

目前大豆肽的制備有化學法、酶解法和微生物發酵法[14]等。由于酶解法存在著生產條件溫和、水解過程易于控制，氨基酸營養價值破壞性小等優點而被廣泛應用[15]。但是由于蛋白質結構復雜，酶又有較強的專一性，單一的酶很難達到理想的水解效果，因此擬選擇不同類型的蛋白酶，采用復合酶解的方法制備大豆肽，以期優化其工藝條件，尋求制備大豆肽的最優試驗方案，為大豆肽的工業制備提供參考和依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食用脫脂豆粕（市售）；堿性蛋白酶（40萬 U/g，A公司）；風味蛋白酶（20萬 U/g，B公司）；中性蛋白酶（40萬 U/g，A公司）；菠蘿蛋白酶（40萬 U/g，B公司）；胰蛋白酶（10萬 U/g，C公司）；細胞色素C（cytochrome C，MW12384），抑肽酶（aprotinin，MW6512），桿菌酶（bacitracin，MW1423），乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（MW451），乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（MW189），均為北京中科質檢生物技術有限公司；氫氧化鈉、硫酸、甲醛均為分析純，天津市科密歐試劑有限公司；乙腈為色譜純，國藥試劑。

1.2 儀器與設備

MS204TS分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；SHA-B水浴恒溫振蕩器（金壇市醫療儀器廠）；TG16-WS離心機（萬豐儀器制造有限公司）；FOSS8400全自動凱氏定氮儀（上海瑞玢國際貿易有限公司）；Seven Compact pH計（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；LC-20AT高效液相色譜系統（SPD-20A紫外檢測器，CTO-20A柱溫箱，7725i手動進樣器，LC solution色譜工作站管理軟件，超聲波脫氣裝置等，日本島津公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 測定與計算方法

蛋白質采用GB 5009.5—2016第一法（凱氏定氮法）進行測定，氨基酸態氮采用GB 5009.235—2016第一法（酸度計法）進行測定。

1.3.2 提取方法

將脫脂豆粕粉碎后過一定目數的篩收集篩下物，配制成濃度為8%的豆粕溶液，調節pH，加酶，一定溫度下振蕩恒溫水浴提取，期間通過酸堿調節控制保持反應體系pH的穩定；復合酶解試驗時，在用前一種酶水解一定時間后，調節溫度和pH，加入其他種酶，繼續提取。達到反應預設時間后，將大豆蛋白水解液加熱至100 ℃，保溫10 min使蛋白酶失活，4 ℃，以6 000 r/min離心20 min，取上清液進行測定。

1.3.3 大豆肽水解酶種類的選擇

根據實際生產用酶和前期資料查閱，試驗選取堿性蛋白酶、風味蛋白酶、中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶5種蛋白酶，根據廠家提供的各種酶的最適作用條件進行初步水解試驗，根據酶解試驗的結果選擇3種優勢蛋白酶進行酶解法生產大豆肽的工藝優化。

1.3.4 單酶酶解條件優化

選取酶解溫度、pH、酶解時間及酶的添加量4個影響蛋白水解率的主要因素，進行單因素試驗。在單因素試驗結果的基礎上進行L9(34)正交試驗，最終確定各種蛋白酶的最佳酶解條件。堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶的正交試驗條件如表1～表3所示。

表1 堿性蛋白酶正交試驗因素水平設計

表2 中性蛋白酶正交試驗因素水平設計

1.3.5 復合酶解試驗

根據正交試驗得出的酶的最優試驗條件進行雙酶和三酶復合酶解試驗，研究復合酶種類和酶解順序對水解率的影響。復合酶解試驗設計如下：

雙酶復合試驗：組1，先堿性蛋白酶后中性蛋白酶；組2，先中性蛋白酶后堿性蛋白酶；組3，先堿性蛋白酶后胰蛋白酶；組4，先胰蛋白酶后堿性蛋白酶；組5，先中性蛋白酶后胰蛋白酶；組6，先胰蛋白酶后中性蛋白酶。

三酶復合試驗：組1，在雙酶試驗組1基礎上再進行胰蛋白酶酶解；組2，在雙酶試驗組2基礎上再進行胰蛋白酶酶解；組3，在雙酶試驗組3基礎上再進行中性蛋白酶酶解；組4，在雙酶試驗組4基礎上再進行中性蛋白酶酶解；組5，在雙酶試驗組5基礎上再進行堿性蛋白酶酶解；組6，在雙酶試驗組6基礎上再進行堿性蛋白酶酶解。

1.3.6 大豆肽分子量鑒定

選取細胞色素C（cytochrome C，MW12384），抑肽酶（aprotinin，MW6512），桿菌酶（bacitracin，MW1423），乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（MW451），乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（MW189），分別用流動相配制成濃度為1.0 g/L左右的上述不同分子質量的肽的標準品溶液，進行過膜上機，得到系列標準品的色譜圖及標準曲線。

將三酶復合水解液進行稀釋，然后過0.45 μm有機膜上機進行色譜分析。色譜條件：色譜柱為TSKgel G2000 SWXL（7.8 mm×300 mm），流動相A為水+0.1%三氟乙酸，流動相B為乙腈+0.1%三氟乙酸，V（流動相A）︰V（流動相B）=55︰45，柱溫25 ℃，流速0.8 mL/min，進樣量20 μL，檢測波長220 nm。

2 結果與分析

2.1 酶種類的確定

在廠家提供的各種酶的最適作用條件下，堿性蛋白酶、風味蛋白酶、中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶對水解率的影響結果如圖1所示。從圖中可以看出，堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶的酶解優勢相對較為明顯，所以試驗選取這3種蛋白酶進行酶解法生產大豆肽的生產工藝優化。

圖1 不同種類蛋白酶對水解率的影響

2.2 蛋白酶酶解條件優化結果分析

2.2.1 單因素試驗結果分析

由單因素試驗得出堿性蛋白酶的較優酶解條件為溫度50 ℃、pH 10.0、水解時間2 h、酶的添加量2.0%；中性蛋白酶的較優酶解條件為溫度40 ℃、pH 7.0、水解時間2 h、酶的添加量1.5%；胰蛋白酶的較優酶解條件為溫度50 ℃、pH 8.0、水解時間2 h、酶的添加量1.5%。

2.2.2 堿性蛋白酶正交試驗結果分析

堿性蛋白酶的正交試驗條件和結果如表4所示。從正交試驗結果可以看出，各因素對水解率的影響的主次順序為D＞C＞A＞B，即酶的添加量＞時間＞溫度＞pH，堿性蛋白酶的添加量是關鍵因素，其次是時間、溫度，再次是pH，同時由均值k得出最佳試驗組合為A3B2C2D3，即酶解溫度為55 ℃，pH為10.0，酶解時間為2 h，酶的添加量為2.5%。在此條件下進行酶解試驗，水解率為21.43%，優于其他各個試驗組（單因素試驗最優組水解率為18.80%）。2.2.3 中性蛋白酶正交試驗結果分析

中性蛋白酶的正交試驗條件和結果如表5所示。從正交試驗結果可以看出，各因素對水解率的影響的主次順序為B＞D＞A＞C，即pH＞酶的添加量＞溫度＞時間，pH是關鍵因素，其次是中性蛋白酶的添加量、溫度，再次是時間，同時由均值k得出最佳試驗組合為A2B2C2D2，即酶解溫度為40 ℃，pH為7.0，酶解時間為2 h，酶的添加量為1.5%。此試驗組為單因素試驗最優試驗組，水解率為17.96%，優于其他各個試驗組。

表4 堿性蛋白酶正交試驗結果

表5 中性蛋白酶正交試驗結果

2.2.4 胰蛋白酶正交試驗結果分析

胰性蛋白酶的正交試驗條件和結果如表6所示。從正交試驗結果可以看出，各因素對水解率的影響的主次順序為D＞A＞C＞B，即酶的添加量＞溫度＞時間＞pH，胰蛋白酶的添加量是關鍵因素，其次是溫度、時間，再次是pH，同時由均值k得出最佳試驗組合為A2B1C1D2，即酶解溫度為50 ℃，pH為7.5，酶解時間為1.5 h，酶的添加量為1.5%。在此條件下進行酶解試驗，水解率為18.36%，優于其他各個試驗組（單因素試驗最優組水解率為16.70%）。

2.3 復合酶解試驗結果分析

雙酶和三酶復合酶解試驗結果如圖2所示。從圖2可以看出：①酶的種類和酶解順序對水解率有著不同程度的影響，復合酶比單酶的水解率更高；②雙酶復合酶解，堿性蛋白酶和中性蛋白酶組合水解率更高，且先堿性蛋白酶后中性蛋白酶的水解率最高，但是較三酶復合試驗組還有一定差距；③三酶復合酶解的水解率明顯高于雙酶復合酶解，先堿性蛋白酶再中性蛋白酶最后胰蛋白酶的水解順序下水解率最高，即先添加2.5%的堿性蛋白酶，控制溫度55 ℃，pH 10.0，酶解2 h，而后添加1.5%的中性蛋白酶，控制溫度40℃，pH 7.0，酶解2 h，最后添加1.5%的胰蛋白酶，控制溫度50 ℃，pH 7.5，酶解1.5 h。在此條件下，大豆蛋白的水解率最高，為39.98%。

分析其原因：堿性蛋白酶和中性蛋白酶屬于內肽酶，作用于肽鏈中間的肽鍵，可以將多肽降解成為很多小肽及少量的氨基酸[16]。胰蛋白酶屬于絲氨酸蛋白酶，能選擇性地水解蛋白質中賴氨酸或精氨酸的羧基端肽鍵，專一性較強。與此同時，堿性蛋白酶還能夠鈍化大豆胰蛋白酶抑制劑，3種酶相輔相成，達到良好的水解效果。

表6 胰性蛋白酶正交試驗結果

圖2 不同試驗組對水解率的影響

2.4 大豆肽分子量鑒定結果分析

按照1.3.6項色譜條件對最優試驗方案下得到的蛋白水解液進行色譜分析，標準品色譜圖和水解液色譜圖如圖3和圖4所示。結果表明水解液中低分子段肽占主要部分，其中相對分子質量小于1 000 Da的占比約為90%，200～1 000 Da范圍的占比在80%以上，所得樣品符合大豆活性肽的要求。

圖3 標準品色譜圖

圖4 大豆肽水解液色譜圖

3 結論與討論

文章以脫脂豆粕為原料，選擇優勢較明顯的堿性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶進行試驗，通過單因素和正交試驗分別確定3種酶的最佳酶解條件。結果顯示：堿性蛋白酶的最佳酶解條件為溫度55 ℃，pH 10.0，時間2 h，添加量為2.5%。中性蛋白酶的最佳酶解條件為溫度40 ℃，pH 7.0，時間2 h，添加量1.5%。胰蛋白酶的最佳酶解條件為溫度50 ℃，pH 7.5，時間1.5 h，添加量1.5%。

通過單酶、雙酶及三酶復合酶解試驗，結果表明酶的種類和酶解順序對脫脂豆粕的水解率有顯著的影響，三酶復合酶解較單酶、雙酶酶解更具優勢。通過研究，最終得出復合酶解法制備大豆肽的最優方案為在8%的底物濃度下，采用各種酶的最佳酶解條件，按照先堿性蛋白酶再中性蛋白酶最后胰蛋白酶的順序進行分步水解，此時大豆蛋白的水解率達到最高，為39.98%。對此條件下得到的酶解液進行液相色譜分析，結果顯示蛋白酶解液中低分子段肽占主要部分，其中相對分子質量小于1 000 Da的占比約為90%，200～1 000 Da范圍的占比在80%以上，符合大豆活性肽的要求。