紅陽獼猴桃果酒加工中果膠酶酶解工藝

韋婷，何靖柳，劉翔，張恒，楊冬雪，程金權

1. 雅安職業技術學院藥學與檢驗學院（雅安 625000）；2. 四川省食品發酵工業研究設計院（成都 611130）

獼猴桃被譽為“果中之王”“天然植物維生素C”。紅陽獼猴桃屬于獼猴桃科獼猴桃屬，是四川省蒼溪縣野生紅肉獼猴桃中選育出來的紅肉新品種，其果肉細嫩多汁，橫截面呈現放射性紅黃色條紋，十分美觀，且具有豐富的維生素C等，深受人們喜愛。在四川省大面積種植，形成蒼溪縣、都江堰市、蒲江縣等地為中心，以雅安市、安縣、北川縣、汶川縣等地為輻射區的獼猴桃產業帶。獼猴桃產量高又是呼吸躍變型水果，不易貯藏運輸，各地都在積極探索果品深加工技術。因為獼猴桃含糖分高，成熟后柔軟多汁，并且富含鈣、鐵、鉀等多種礦物質及17種氨基酸[1]，加工成果酒后酒精度數不高、成分豐富，是近年研究較多的產品形式，并且已經工業化生產。但在果酒生產貯藏中因原料中果膠、單寧、奎寧酸、酒石酸等含量高，使得產品存在出汁率低、酸澀味重及裝瓶后沉淀渾濁現象[2-4]，嚴重影響獼猴桃果酒的品質和企業效益。根據果膠酶應用于獼猴桃酒的研究報道，證實果膠酶能有效分解果實中果膠質，從而提高果汁的出汁率[5-9]。但果膠酶應用于紅陽獼猴桃的報道還較少，以四川雅安市出產紅陽獼猴為原料，探索果膠酶在紅陽獼猴桃果酒加工中對出汁率、原酒感官、酒精度、澄清度等方面的影響，為紅陽獼猴桃果酒的研發提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與試劑

紅陽獼猴桃（雅安市雨城區）；優質白砂糖（蔗糖分≥99.6%，雅安市吉選超市）；發酵菌種GT-2（實驗室自行篩選鑒定保藏）；果膠酶（食品級，酶活力單位＞50 000 U/g，河南萬邦實業有限公司）；濃鹽酸（含量≥36.0%，四川西隴化工）；氫氧化鈉（成都科龍化工）；葡萄糖（天津市致遠化學試劑）；無水硫酸銅（成都科龍化工）；酒石酸鉀鈉（成都科龍化工）。試劑均為分析純。

1.1.2 培養基

獼猴桃清汁培養基[2]：成熟紅陽獼猴桃去皮破碎榨汁，按20 mg/L比例加入果膠酶于40 ℃下酶解2 h，加入白砂糖調整糖度至200 g/L，115 ℃高壓滅菌15 min。

1.2 主要儀器設備

YXQ-LS-100S11型立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）；BSC-1600ⅡA2型生物安全柜（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司）；ZWYR-2012C型氣浴恒溫振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）；VAL-3N型酒精比重計（杭州匯爾儀器設備有限公司）；LB32T型手持糖度折光儀（廣州市速為電子科技有限公司）；ME204E/02電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；UV-1601型分光光度計（北京瑞利分析儀器）；雷磁DZ-2型自動電位滴定儀（上海儀電科學儀器股份有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 果酒工藝流程

紅陽獼猴桃→挑選→清洗→破碎壓榨→果膠酶酶解→過濾→成分調整→滅菌→接種酵母→主發酵→后發酵→陳釀→滅菌→成品

1.3.2 工藝關鍵條件

1) 原料及處理

選用無病害，八成熟，雅安市雨城區所產紅陽獼猴桃。果實80～120 g，果實可溶性固形物含量13%～15%，研究多以去皮果肉為原料，考慮工業化生產實際情況，全部以帶皮果實為原料。將原料清洗瀝干，打漿混勻，置于帶棉塞滅菌三角瓶中。

2) 果膠酶配制及酶解

精確稱量果膠酶2 g，用4～5倍40～50 ℃溫水溶解后，加入40～50 ℃溫水稀釋定容，配制成1%（10 mg/mL）溶液，放置備用[5]。用移液管吸取不同量的果膠酶液加入獼猴桃果漿中，于不同溫度水浴鍋中保溫酶解不同時間。酶解結束后用300目濾網過濾取汁，調整成分，分裝于250 mL三角瓶。

3) 菌種制備

在生物安全柜內，將GT-2從斜面保藏管取出，接種到用白砂糖調整糖度200 g/L滅菌獼猴桃清汁液體培養基，置于氣浴恒溫振蕩器中培養，設置轉速150 r/min，溫度28 ℃，培養72 h后，鏡檢確認無雜菌污染，生長良好后按體積分數5%接種到酶解后的獼猴桃原料中。

4) 前發酵

將不同酶解處理的酶解液置于22 ℃恒溫培養箱中發酵7 d。

5) 后發酵

前發酵完成后用400目濾網過濾裝瓶，置于15 ℃下后發酵30 d。

1.3.3 酶解溫度對出汁率和原酒品質的影響

1) 寬范圍酶解溫度試驗

將獼猴桃壓榨破碎成全果漿后混勻，稱取6份150 mL樣品分別置于250 mL帶棉塞的滅菌三角瓶，固定添加果膠酶添加量80 mg/L，酶解時間120 min，選擇20，30，40，50，60和70 ℃[5]較寬溫度范圍下進行酶解，酶解完成立即榨汁過濾計算出汁率。濾液用白砂糖調整糖分至200 g/L，加5%菌液后置于22 ℃恒溫培養箱發酵7 d，過濾，進行原酒感官評價。出汁率按照式（1）進行計算，原酒感官按照表1進行評分。

表1 紅陽獼猴桃果酒原酒感官評分表

2) 細化溫度區間試驗

通過寬范圍試驗以后，發現60 ℃酶解后出汁率最高，細化溫度區間，以45，55，60，65和75 ℃重復上述步驟，確定單因素下最佳酶解溫度。

1.3.4 酶添加量對出汁率和原酒品質的影響

1) 寬范圍酶添加量試驗

將獼猴桃壓榨破碎成全果漿后混勻，稱取5份150 mL樣品分別置于250 mL帶棉塞的滅菌三角瓶，固定酶解溫度60 ℃，酶解時間120 min，選擇40，60，80，100和120 mg/L[4,10]較寬溫度范圍下進行酶解，酶解完成立即榨汁過濾計算出汁率。濾液用白砂糖調整糖分至200 g/L，加5%菌液后置于22 ℃恒溫培養箱發酵7 d，過濾，進行原酒感官評價。

2) 細化酶添加量試驗

通過寬范圍試驗以后，發現100 mg/L酶添加量下出汁率最高，細化酶添加量區間，以90，100，110，120和130 mg/L重復上述步驟，確定單因素下最佳酶添加量。

1.3.5 酶解時間對出汁率和原酒品質的影響

1) 寬范圍酶解時間試驗

將獼猴桃壓榨破碎成全果漿后混勻，稱取5份150 mL樣品分別置于250 mL帶棉塞的滅菌三角瓶，固定酶解溫度60 ℃，果膠酶添加量100 mg/L，通過文獻參考[5,8,11]并考慮獼猴桃果漿品質保持和生產效率，選擇40，80，120，160和200 min較寬時間范圍下進行酶解，酶解完成立即榨汁過濾計算出汁率。濾液用白砂糖調整糖分至200 g/L，加5%菌液后置于22 ℃恒溫培養箱發酵7 d，過濾，進行原酒感官評價。

2) 細化酶解時間試驗

通過寬范圍試驗以后，發現酶解時間與出汁率呈波浪狀關系，細化酶解時間區間，以40，60，80，100，120，140和160 min重復上述步驟，確定單因素下最佳酶解時間。

1.3.6 酶解正交試驗

預試驗做過靜置酶解和搖床酶解（50 ℃，加酶量40 mg/L，空氣搖床120 r/min，酶解150 min）對比，發現靜置酶解的出汁率和原酒感官均優于搖床酶解，所以酶解方式選擇靜置酶解。預試驗設計調整酶解到最佳pH范圍，但通過文獻分析和實測獼猴桃果槳的pH，認為獼猴桃果漿pH 3.5，本身就在果膠酶提高出汁率[12-13]、提高發酵風味[8,14]和提高發酵液澄清度[5,15]各指標較理想的pH范圍（pH 3.3～4.5），另外獼猴桃酸度已經較高，其果酒制作中的關鍵技術之一就是降酸處理，不適合人為加入酸度調節劑，所以和孫強等[12]，選擇以紅陽獼猴桃自然酸度進行酶解。最終選擇酶解溫度（A）55，60和65 ℃，果膠酶添加量（B）100，110和120 mg/L，酶解時間（C）100，120和140 min，進行3因素3水平的正交試驗，以出汁率和感官評分的綜合得分率作為評價指標。

1.3.7 正交結果驗證及原酒指標檢測

按照正交試驗所得的最佳酶解組合進行酶解，接種5%的GT-2菌液，于22 ℃恒溫培養箱中發酵7 d。做2個平行驗證出汁率和原酒感官評分，檢測原酒中殘糖（總糖）、酒精度、總酸含量和澄清度；同時做2個不酶解的樣品平行，做相同的指標檢測，進行對比。酒精度測定，采用酒精計法[16]；殘糖測定，采用菲林試劑法[17]；總酸（以酒石酸計）測定，采用電位滴定法[18]；以蒸餾水為參比，用紫外分光光度計于680 nm[19]處測過濾后靜置24 h的透光率反映原酒的自然澄清度。

2 結果與分析

2.1 酶解溫度對出汁率和原酒品質的影響

根據1.3.3的步驟（1）和步驟（2）試驗所得數據作表2和圖1。

由表2和圖1可知，紅陽獼猴桃全果漿的出汁率在20～60 ℃溫度范圍內，呈逐漸上升趨勢，60 ℃達到最高值82.58%，隨著溫度繼續上升，出汁率開始小幅度下降；總體來說50～65 ℃之間，出汁率均在81.5%以上，差別不大。說明果膠酶酶解紅陽獼猴桃漿的適宜溫度在50～65 ℃，繼續升高溫度，對出汁率沒有更大的貢獻。從酶解液發酵后的原酒感官來看，酶解溫度較低時，如20～30 ℃時，原酒香氣保留較好，整體評分還高于40～50 ℃，但低溫酶解對原酒酸澀滋味改善很小；滋味改善較突出和感官評分較高是在55～65 ℃區間，感官評價最優的酶解溫度也是60 ℃，得分在70分。但溫度高于60 ℃，原酒感官開始劣變，75 ℃酶解的發酵液感官評分降低顯著。可以看出酶解溫度60℃，紅陽獼猴桃果槳出汁率和感官均最優。分析原因應是60 ℃下，果膠酶能有效將果汁中的果膠水解，并且會加快單寧的溶出[20]和沉淀[21]，提高其穩定性，減輕澀味；但溫度再升高，使原料的風味和營養物質分解揮發程度加大，不利于果酒保持品質。

表2 不同酶解溫度原酒的感官評價

圖1 不同酶解溫度出汁率

2.2 酶添加量對出汁率和原酒品質的影響

根據1.3.4的步驟（1）和步驟（2）試驗所得數據作表3和圖2。

由表3和圖2可知，果膠酶添加量40～120 mg/L時，與出汁率成正比，果膠酶添加量120 mg/L時，出汁率達到最高，為82.21%，果膠酶添加量100～130 mg/L時，出汁率均較高，在80%以上。結果表明，果膠酶添加量在一定范圍內與獼猴桃果汁出汁率成正相關，但是不能無限制增加果膠酶含量，一是因為有拐點存在；二是有研究顯示果膠酶的添加會增加果酒中甲醇[22]含量；三是增加生產成本。從感官指標來看，40 mg/L果膠酶添加下，原酒的色澤橘紅明艷、香氣豐富，滋味典型，提高原酒感官評分；但是氣味和滋味中都帶有明顯澀味，缺陷明顯。分析應為果汁中單寧沒有充分溶出和沉淀。果膠酶添加量60～130 mg/L時，感官指標呈正態分布，果膠酶添加量100 mg/L時，原酒色澤橘紅、澄清，果香怡人，滋味微酸但無澀味，感官評分最高88分。果膠酶添加量130 mg/L時，原酒感官明顯劣變。因此，以出汁率為指標，果膠酶添加量120 mg/L最優，以感官評價為指標，果膠酶添加量100 mg/L最優。

圖2 不同果膠酶添加量出汁率

2.3 酶解時間對出汁率和原酒品質的影響

根據1.3.5的步驟（1）和步驟（2）試驗所得數據作表4和圖3。

由表4和圖3可知，試驗時間內，出汁率呈波浪上升狀態，酶解時間60 min達到第1個波峰，出汁率81.45%；酶解時間120 min時達到第2個波峰，出汁率82.93%；酶解時間200 min時出現最高值，出汁率83.59%。總體來看，酶解時間越長，酶解越充分，出汁率越高。從感官指標來看，酶解40 min，原酒的顏色最為紅艷明亮、澄清，但是氣味和滋味中澀味明顯，所以感官得分偏高但不是最高。酶解時間60～200 min，感官得分率呈正態分布，酶解時間120 min下，感官得分最高，為88分。酶解時間200 min時，雖然出汁率最高，但是由于果漿中單寧、蘋果酸等澀味物質溶出過多，使得原酒感官澀味很重，降低感官評分。因此，最佳酶解時間120 min。

表4 不同酶解時間原酒的感官評價

圖3 不同酶解時間出汁率

2.4 正交試驗結果及分析

通過對表5和表6的分析可知，各因素對綜合評分的影響大小A＞B＞C，即酶解溫度＞酶添加量＞酶解時間。得到最優方案為A2B3C3，即60 ℃，酶添加量120 mg/L，酶解140 min的組合最優。其中，因素A酶解溫度對酶解綜合評價指標有顯著性影響。分析應為適當溫度下，隨著酶解時間延長，可溶性單寧不斷溶出[20]；果膠酶，主要是聚半乳糖醛酸酶[23]可以更有效地水解果汁中的果膠物質以及多糖，使果膠黏度降低，果汁中的單寧失去果膠的保護作用而與其他膠體共同沉淀[22]；不僅提高出汁率，也降低果酒中的澀味。另外，適宜溫度加上果膠酶作用，是否能降低獼猴桃汁中有機酸研究未見報道，但有研究表明兩者的協同作用能降低山楂汁酸度[24]，試驗從感官評價和總酸測定上也發現對獼猴桃果酒有降酸的作用，但具體影響還需進一步研究。

表5 L9(33)正交試驗設計與結果

表6 方差分析

2.5 正交結果驗證及指標測定

按正交試驗得到的最佳工藝進行酶解驗證，將出汁率、酶解后發酵的原酒和未酶解直接發酵的原酒進行各項指標檢測，結果列于表7和表8。

數據對比來看，是否酶解對紅陽獼猴桃原酒的殘糖和酒精度基本沒有影響，這2個指標主要還是與起始糖度和菌種發酵能力有關；對總酸有一定降低作用；對果酒澄清度有較大提高；同時酶解對出汁率和原酒感官的貢獻很明顯，出汁率平均提高16%，感官得分率平均提高7%，達到并且提高主要在口感滋味方面，這對于生產企業降低生產成本、提高市場競爭力都具有積極意義。

表7 最佳酶解和未酶解發酵原酒指標對比

表8 最佳酶解和未酶解發酵原酒指標對比

3 結論

通過酶解溫度、酶添加量、酶解時間等單因素試驗及正交試驗探索果膠酶在紅陽獼猴桃果酒加工中對出汁率、感官評價的影響。結果表明，酶解溫度對酶解后出汁率和原酒感官評價的綜合影響最顯著，酶添加量和酶解時間也是工藝中要調控的重要因素。酶解pH以獼猴桃自然pH較適宜，酶解以靜置方式為佳。試驗證明，以紅陽獼猴桃為原料發酵果酒，最佳酶解工藝為：自然pH 3.5，靜置狀態下，酶解溫度60 ℃、添加酶量120 mg/L、酶解時間140 min。該工藝下發酵的紅陽獼猴桃果酒與未酶解樣品相比，出汁率平均提高16%，達到81.17%；感官得分率平均提高7%，得分率達到82%，并且顏色、香氣、口感滋味方面更加協調無明顯缺陷。同時總酸含量降低，自然澄清度增加，殘糖和酒精度與未酶解的樣品無明顯區別，這對于生產企業降低生產成本、提高市場競爭力都具有積極意義。