響應面法優化黑參中類黑精的提取工藝

陳立彪，朱鳳妹，李軍*

河北科技師范學院（秦皇島 066000）

類黑精是一種結構非常復雜，顏色呈深褐色，主要由羰基化合物（還原糖、不飽和脂肪酸、醛、酮等）與氨基化合物（氨基酸、肽、蛋白質等含氮化合物的游離氨基）之間發生美拉德反應生成的一種大分子高聚物[1]，具有抗氧化活性[2]、促進鐵吸收[3]、抑菌[4]、降血壓[5]等生理作用。黑參經九蒸九曝加工完成后富集了大量類黑精物質[6]，將其從材料中充分提取，可保證類黑精的有效開發與利用。

國內外對于類黑精的提取做了大量研究。王明慧等[7]選用乙醇水溶液浸提法，確定了從糯米藕中提取類黑精的最佳工藝參數：乙醇體積分數10%，料液比1︰40（g/mL），浸提溫度80 ℃，浸提時間1.5 h。秦禮康等[8]以陳窖豆豉為原料，通過不同體積分數乙醇為提取溶劑，確定了最佳提取條件：乙醇體積分數10%，料液比1︰3（g/mL），浸提24 h。張會娟等[9]采用乙醇丙酮分級沉淀、超濾、冷凍干燥的方法提取類黑精，研究表明分級提取時先乙醇提取后丙酮提取可提取出大部分類黑精。因此使用Box-Behnken響應面法優化提取工藝條件，通過連續變量建立曲面模型，對其影響因素交互作用進行分析，確定最佳水平范圍。此次試驗可行性強，試驗組數相對較少，可有效節約資源[10-11]。通過響應面法確定出最佳的提取工藝條件，目的是進一步發掘黑參的可利用程度，為黑參的綜合利用提供技術依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

長白山新鮮人參（通化縣崇參人參種植合作社）；無水乙醇、蒸餾水（均為分析純）。

1.2 儀器與設備

YXQ-LS-50A立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博訊醫療生物儀器股份有限公司）；UV-2550紫外分光光度計（日本島津公司）；HH-4數顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市杰瑞爾電器有限公司）；SQP電子天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；80-2離心機（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；FW-400A傾斜式萬能粉碎機（北京中興偉業儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 黑參的炮制工藝

炮制工藝是傳統韓藥材“九蒸九曝”的制作方法。首先選取4年生鮮人參，其大小適中，單支質量在40 g以上，無斑痕，無霉斑，清洗除雜，采用高溫滅菌鍋進行蒸制，并且固定蒸制溫度110 ℃、蒸制時間2 h、干燥溫度50 ℃、干燥時間12 h，此條件下進行9次循環[12]。將其粉碎過60目篩，適宜條件保存備用。

1.3.2 單因素試驗

1) 確定最佳溶劑提取濃度：精確稱取0.3 g黑參粉末，無損地轉移到燒杯中，分別加入30 mL 0%，10%，20%，30%，40%和50%乙醇溶液，置于50 ℃水浴鍋中120 min，以4 000 r/min離心15 min，取上層清液，測定其420 nm波長下的吸光度（由于A420與類黑精量呈正相關性，因此A420可反映出黑參中提取的類黑精含量[13]。）

2) 確定最佳料液比：精確稱取30 mL 40%乙醇溶液，分別加入料液比為1︰10，1︰30，1︰50，1︰70，1︰90和1︰110（g/mL）黑參粉末，置于50 ℃水浴鍋中120 min，以4 000 r/min離心15 min，取上層清液，測定其420 nm波長下的吸光度。類黑精量（AV值）=A420（吸光度）×V（相對體積比倍數）[14]，相對體積比倍數指料液比倍數。

3) 確定最佳水浴時間：精確稱取0.43 g黑參樣品，加入30 mL 40%乙醇水溶液，置于50 ℃水浴鍋中，分別考察不同的水浴時間（0，30，60，90，120和150 min），以4 000 r/min離心15 min，取上層清液，測定其420 nm波長下的吸光度。

4) 確定最佳水浴溫度：精確稱取0.43 g黑參樣品，加入30 mL 40%乙醇水溶液，分別考察不同的水浴溫度（50，60，70，80，90和100 ℃），置于水浴鍋中加熱60 min，以4 000 r/min離心15 min，取上層清液，測定其420 nm波長下的吸光度。

1.3.3 黑參類黑精提取條件優化

根據Box-Behnken試驗設計原理，在單因素試驗的基礎上，綜合考慮各因素對類黑精提取量的影響，選取對類黑精提取量影響較為顯著的溶劑體積分數、水浴時間、水浴溫度3個因素，以類黑精提取液的吸光度為響應值，建立三因素三水平的試驗設計，確定最優提取工藝。響應面分析因素及水平見表1。

表1 響應面分析因素和水平

1.3.4 提取率與提取級數的測定

在確定最佳提取條件下，多次浸提0.5 g黑參粉末，直至浸提液接近于無色，分別收集各次的浸提液吸光度Ai并測體積Vi（mL）與；最后合并各次提取液，得到總體積V（mL）與總吸光度A，計算各次的提取率，確定提取級數，提取率按式（1）計算[15]。

2 結果與分析

2.1 黑參中類黑精提取的單因素試驗結果

2.1.1 溶劑體積分數對黑參中類黑精提取效果影響

隨著乙醇體積分數的增大，黑參中類黑精的提取量呈現先增加后逐漸降低的趨勢。當乙醇體積分數為40%時，提取量達到最大，A420為0.421，但此體積分數與乙醇體積分數20%和30%的溶劑提取效果無顯著差異（p＞0.05）；當乙醇體積分數進一步增加至50%時，類黑精的提取量顯著下降（p＜0.05）。適宜的乙醇體積分數有利于類黑精的提取，同時乙醇溶劑使類黑精的結構與功能更加穩定，還能使一些水溶性蛋白和雜質形成沉淀[16]，從而使類黑精的提取純度更高。因此，選取40%的乙醇溶液。

圖1 溶劑體積分數對黑參中類黑精提取效果影響

2.1.2 料液比對黑參中類黑精提取效果影響

隨著料液比増加，黑參中類黑精提取量呈先增加后再下降的趨勢。當料液比為1︰70（g/mL）時，提取類黑精的AV值為13.97，提取量達到最大，其中料液比1︰70，1︰50和1︰90（g/mL）的提取效果間無顯著差異（p＞0.05）。當料液比大于1︰70（g/mL）時，類黑精的提取量下降。在一定范圍內增加提取溶劑量影響固相主體與液相主體之間的濃度差，有助于提高溶劑擴散率和傳質速率，但溶劑量過大會導致浸出的類黑精對未浸出產物有一定抑制作用，且提取完全所需時間相應延長[17-18]。因此，選取料液比1︰70（g/mL），但料液比因素對類黑精的提取量影響并不顯著（p＞0.05），因此不作為響應面考慮因素。

圖2 料液比對黑參中類黑精提取效果影響

2.1.3 水浴時間對黑參中類黑精提取效果影響

隨著水浴時間的增加，類黑精的提取量呈現先增加后趨于穩定的趨勢。在水浴時間60 min內，類黑精提取量顯著増加（p＜0.05），60 min時達到最大提取量，A420為0.37；當水浴時間為60～150 min時，類黑精提取量較為恒定，提取量無顯著性差異（p＞0.05）；說明在水浴提取60 min時，黑參中類黑素的提取較為完全，水浴時間的延長并不能提高類黑精的浸提效果，也可能由于溶劑揮發導致乙醇體積分數降低，浸提效果并未增強[19]。因此，提取黑參中類黑精時的水浴時間為60 min。

圖3 水浴時間對黑參中類黑素提取效果影響

2.1.4 水浴溫度對黑參中類黑精提取效果影響

隨著提取溫度的升高，黑參中類黑精提取量顯著增加（p＜0.05），當水浴溫度達到80 ℃時，黑參中類黑精的提取量達到最大值，A420為0.455。當水浴溫度高于80 ℃時，提取量較為恒定，且無顯著差異性（p＞0.05）。當水浴溫度的升高時，類黑精分子運動的速度加快，有利于黑參中類黑精的溶解和釋放。但水浴溫度超過80 ℃時，可能乙醇溶劑的揮發和類黑精溶解程度較為完全，因此提取量并未得到較大提升。同時，溫度持續升高還可能破壞其結構功能[20-21]。

圖4 水浴溫度對黑參中類黑素提取效果影響

2.2 黑參中類黑精提取的的響應面優化試驗結果

2.2.1 響應模型的建立與分析

在單因素試驗的基礎上，綜合考慮各因素對黑參中類黑精提取效果的影響，依據Box-Behnken試驗設計原理，通過響應面法對溶劑體積分數、水浴溫度、水浴時間3個因素分析得到試驗方案和結果。對表2中的數據進行多元回歸擬合，獲得黑參中類黑精對編碼自變量溶劑體積分數、水浴溫度、水浴時間的二次多項回歸方程：類黑精提取液吸光度=+0.47-7.375E-003A-2.125E-003B+0.015C+4.750E-003AB-1.000E-003AC-0.011BC-0.038A2-0.030B2-0.023C2。

表2 響應面分析方案與結果

從表3可以看出，在黑參提取過程中整體模型的F=574.00，模型回歸值p＜0.000 1，表明回歸模型極顯著，其中一次項A、C、AB、BC和二次項A2、B2、C2均表現出極顯著水平，一次項B表現出顯著水平。由溶劑體積分數（A）、水浴時間（B）、水浴溫度（C）的F值可知，各影響因素的主次順序為水浴溫度（C）＞溶劑體積分數（A）＞水浴時間（B）。失擬項是用來表示模型與試驗擬合程度，也就是二者的差異程度。同時，失擬項F=2.99，p=0.158 8，失擬項不顯著，表明該模型對試驗有著良好的一致性[22]，模型中調整系數R2Adj=99.69%，說明99.69%響應值的變化可以通過該模型解釋，相關系數R2=99.86%，表明模型與試驗有很好的擬合度，此模型可以分析與預測黑參中類黑精的提取量，有較高的可信度。

表3 回歸方程方差分析

2.2.2 提取黑參中類黑精的響應面分析

圖5 各因素交互作用對黑參中類黑精提取效果的影響

為進一步分析溶劑體積分數、水浴溫度、水浴時間對其類黑精的提取率的影響，將其中任一因素固定為0水平，可得到另外兩個因素交互作用的響應面圖和等高線，如圖5所示。從響應面圖和等高線可直觀地看出溶劑體積分數、水浴時間和水浴溫度間的交互作用可反映出因素對其黑參中類黑精提取率的影響。等高線形狀和響應面曲面坡度可以反映自變量交互效應的強度。等高線形狀若趨向于橢圓形，則兩自變量之間交互作用明顯；等高線密度大，表明因素間交互作用較強；響應面圖曲率越大，即坡度越陡，說明因素間交互作用越顯著[23]。由此分析可知，水浴時間與水浴溫度、溶劑體積分數與水浴時間之間的交互作用對其類黑精的提取率影響極顯著，溶劑體積分數與水浴溫度的交互作用對其響應值影響不顯著，這與表3回歸方程方差分析結果一致。

2.2.3 確定最佳提取條件與驗證回歸模型

通過響應面法得到黑參中類黑精最佳提取工藝參數：乙醇體積分數39%、料液比1︰70（g/mL）、水浴時間57 min、水浴溫度84 ℃。此工藝條件下黑參中類黑精提取液理論吸光度為0.472，按此工藝參數進行試驗驗證，得到類黑精吸光度平均值為0.467，其相對誤差約為1.06%，說明回歸方程模型比較可靠，具有一定的實踐指導意義。

2.3 提取級數的確定

通過上述試驗，在黑參中類黑精最佳提取工藝的條件下，分級多次浸提黑參粉末樣品，通過1.2.4中方法計算黑參中類黑精在不同級數的提取率。如表4所示，隨著黑參中類黑精提取級數的增加，提取液中類黑精的提取量也在增大，經2次提取類黑精的提取率已經達到93.2%，提取較為完全，因此對于黑參中類黑精的最佳提取級數為2級。

表4 提取級數對提取效果影響

3 結論

試驗以九蒸九曝方式加工成的黑參為原料，通過響應面法優化了黑參中類黑精提取工藝，黑參中類黑精的最佳提取工藝為溶劑體積分數39%乙醇溶液、料液比1︰70（g/mL）、水浴時間57 min、水浴溫度84℃，在最佳工藝的條件下測得類黑精提取液吸光度為0.467，與預測值基本一致，最佳提取級數為2級，提取率為93.2%。此次試驗進一步發掘了黑參的可利用程度，為黑參的綜合利用提供技術依據。